基于DNAzyme及HCR信号放大的新方法研究

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核酸探针具有信号转换机制灵活、稳定性好、容易合成等优势,结合核酸探针信号放大技术,可实现目标物质的灵敏检测。其中,DNAzyme和hemin结合后,具有生物催化活性,可以实现多倍信号放大。杂交链式反应(HCR)利用引发链引发,形成有缺口的核酸长链,可作为信号放大的平台。两种信号放大技术都可以在恒温无酶条件下进行,简单易操作,可实现目标物的放大检测。基于此,本文着眼于利用DNAzyme及HCR放大技术,利用比色与表面增强拉曼散射(SERS)信号转导技术,实现目标物质的灵敏检测。包括如下三个方面的工作:(1)利用G-四聚体和hemin结合产生生物催化活性及ATP对显色反应的积极促进作用,发展了基于hemin/G-四聚体/ATP DNAzyme(HGAD)免标记的可视化放大检测ATP的方法。设计合成了一条在茎部固定G-四聚体序列的可激活的发夹结构,当目标物ATP存在时,ATP可引发发夹结构发生改变,形成具有催化活性的HGAD复合物,同时ATP还可以使过氧化氢氧化ABTS2-生成氧化产物ABTS.-的趋势增加,进一步信号放大。本方法可有效降低背景信号,高灵敏、高选择、可视化检测生物小分子ATP。(2)基于杂交链式放大技术(HCR)及表面增强拉曼散射(SERS)信号转导技术,发展了高灵敏检测DNA的方法。本体系利用目标DNA存在时释放出引发单链,引发HCR杂交链式反应,并通过亲和素和生物素的特异性作用,将标记有亲和素和拉曼信号分子的金纳米颗粒连接到HCR长链,形成HCR-Au探针,使拉曼信号探针靠近,拉曼信号增强,从而实现目标核酸链的灵敏检测。引入第三个将引发链固定在结构茎部的发夹结构,可以增加体系的通用性,只需改变此发夹结构的部分序列就可以实现对不同的目标物质的检测。本方法稳定性好、灵敏度高、通用性好。(3)在上一章的基础之上,本章发展了一种基于HCR放大的SERS单细胞水平检测急性白血病淋巴细胞(CEM)细胞的方法。本体系利用与核酸适体连接的引发链引发HCR杂交链式反应,形成HCR-Au探针。HCR-Au探针与细胞孵育后,可以靶向实现CEM细胞在单细胞水平的检测。本方法综合利用了HCR无酶恒温信号放大、核酸适体的高特异性及SERS灵敏度高、分辨率高、稳定性好等优势实现对CEM细胞在单细胞水平的检测。
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