【摘 要】
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限制性内切酶BamHI的标准化的制定内容包括了BamHI的分类及名称、技术指标、检验方法、检验规则及标志、包装、运输和贮存。本论文主要探讨了限制酶的生物活性测定,酶的纯度(有
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限制性内切酶BamHI的标准化的制定内容包括了BamHI的分类及名称、技术指标、检验方法、检验规则及标志、包装、运输和贮存。本论文主要探讨了限制酶的生物活性测定,酶的纯度(有无杂酶)检测,设计了各个技术指标的检验方法,这些是限制酶的标准化工作中最关键的,也是最核心的内容。
在限制酶的生物活性测定方法中,选用了已经被研究清楚的LambdaDNA作为酶切底物,由于LambdaDNA上存在着许多限制酶的识别序列,所以它还可作为其他的限制酶的作用底物,具有广泛的通用性。本实验方法中还借助了多重PCR技术,通过合理的设计,更精确地测定了限制性内切酶的活性单位。
在过量过夜消化实验鉴定中,主要检测产品酶中是否含有其他的非特异性的核酸酶。底物经过过量长时间酶切后的电泳条带带型和完全酶切后的典型的电泳条带带型没有任何区别,就可以说明产品酶中不存在其他的非特异性的核酸酶。
在酶切-连接-再酶切实验中,主要是检测产品酶中是否含有外切核酸酶,磷酸酶和其他的内切酶。这些酶会破坏限制酶酶切后产生的黏性末端的完整性,不完整的黏性末端将不能被顺利地连接在一起,即便是错误地被连接在一起,限制酶的识别序列也不会存在了,连接起来的DNA就不能被该限制酶切割了。所以,本实验完全能够检测出产品酶中存在的这些杂酶。
蓝白斑筛选鉴定实验中,利用了便于检测的α-互补现象,从基因的功能方面,间接地检验了产品酶中是否存在破坏酶切形成的黏性末端的微量杂酶,比如外切核酸酶等。在生物体内,只有完整的DNA序列才能编码出具有相应生物功能的蛋白质,若DNA序列中少几个碱基,翻译时会发生移码突变,那么就不会表达出具有原来生物功能的蛋白质。本检测方法正是基于这个原理建立起来的,加上α-互补现象本身的颜色变化,使检测结果一目了然。
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