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化学小分子与生物大分子的相互作用,尤其是人工核酸定位切断试剂对DNA的切断在DNA序列测定、染色体分析、基因治疗以及DNA重组方面有着广泛的用途,因此进行人工合成限制性内切核酸酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。同时,随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透,利用纳米技术研究和解决生命科学领域中的重大问题,推动纳米生物技术的发展,正成为当前重要的前沿研究领域之一。本论文在这两者的交叉领域进行了较为系统的研究,并取得了以下几个有意义的结果。
(1)一般人工核酸定位切断试剂由识别和切割系统两个系统构成。本文中,我们采用PNA作为识别系统,Ce(Ⅳ)配合物切割系统,合成了PNA-Ce(Ⅳ)配合物人工核酸定位切断试剂(人工核酸酶),并用MALDl-TOF质谱对其进行了表征,运用荧光光谱法研究了该识别系统PNA与其部分互补的靶标26mers单链DNA(ssDNA)的杂交,用PNA-Ce(Ⅳ)配合物人工核酸酶在生理条件下对靶标26mersssDNA进行了定位切断,并用离子对反相高效液相色谱对反应产物进行了分析,试验结果表明该试剂对靶标ssDNA的定位切断取得了满意的效果。
(2)其后,我们通过共价键合的方法将将PNA探针连接到磁性纳米粒子表面(MNPs),并将其与靶标DNA进行了杂交。同时,建立了一种基于表面增强拉曼光谱对PNA在磁性纳米粒子表面的键合及其与靶标DNA的杂交过程进行检测的方法。实验结果表明:建立的方法是有效的;PNA探针已成功地键合到磁性纳米粒子的表面,并且仍然有很好的生物活性。
(3)将以寡聚核苷酸(ODN)为识别系统的人工核酸定位切断试剂共价键合到磁性纳米的表面,得到了基于磁性纳米粒子的ODN人工核酸切割试剂(即ODN磁性纳米人工内切酶),其后我们利用其对靶标DNA进行了定位切断实验,实验结果表明,该ODN磁性纳米人工内切酶在合适的条件下,能够迅速有效的对靶标DNA进行切断,且切断位点与理论预期的一致。随后,我们尝试以类似的方法将PNA核酸定位切割试剂连接到磁性纳米粒子上,制成了基于磁性纳米粒子的PNA人工核酸切割试剂(即PNA磁性纳米人工内切酶),并对其初步进行了定位切断实验,实验结果表明,合成的PNA磁性纳米人工内切酶能够对靶标DNA进行定位切断,切割后产物是预期的产物。