HBV(hepatitis B virus，HBV)感染易引起慢性肝炎，部分最后转化成肝癌。最近研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ER stress）参与了肿瘤的发生和发展，但作用机制仍不明确。HBV是嗜肝DNA病毒家族的溶原性病毒，其基因组呈松弛环状双链结构，含4个开放读码框架(open reading frame，ORF)，其中X区编码产物(hepatitis B virus X protein．HBx)蛋白是一种多功能的调节蛋白，在胞内信号转导、病毒复制转录、细胞增殖与凋亡、细胞周期进程、蛋白降解和肝细胞的遗传稳定性等方面均有确切作用。鉴于HBx蛋白在慢性肝脏疾病发生发展中也发挥重要的作用，因此最近相关方面的研究很多。ER应激是真核细胞的一种保护性应激反应，它是通过激活未折叠蛋白反应（unfolded proteinresponse，UPR）通路，以此来减少细胞内蛋白的异常聚集，起到细胞保护作用。研究表明它与很多因素所致疾病的发生发展密切相关。MANF (mesencephalicastrocyte-derived neurotrophic factor, MANF)基因是我们从30000个基因中筛选出来的并对ER应激最敏感的基因，它是一种分泌性蛋白，ER应激能诱导其表达上调。我们推测，MANF很可能在肝炎到肝癌的转变中起着重要的作用，本文将对此进行相关的研究。目的：建立稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的HepG2稳转细胞系，并检测HBx蛋白过度表达对HepG2细胞生物学活性的影响，同时对ER应激最敏感的基因MANF在肝癌发生发展中所起的相关作用进行研究。方法：采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段，构建pcDNA3.1-HBx真核表达质粒，利用脂质体将pcDNA3.1-HBx转染人HepG2细胞系，通过G418筛选后，经Western blot法对HBx的表达进行验证。用MTT法检测稳转细胞的增殖活性；用PCR法检测HBx过表达引起ER应激相关基因表达的变化；选择其中变化明显的MANF基因并将其用siRNA敲低，用MTT法检测瞬转细胞的增殖活性，用transwell迁移实验和transwell侵袭实验检测瞬转细胞的迁移和侵袭能力的变化。结果：1.建立稳定表达pcDNA3.1-HBx蛋白的细胞系1.1PCR扩增HBx基因采用RT-PCR法从HepG2.2.15细胞株中克隆HBx基因编码区片段，将扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，约在500bp处可见明显的扩增产物条带，扩增的片段大小和理论预测值相符。1.2重组质粒阳性克隆的筛选及鉴定将上述得到的PCR产物进行胶回收，然后与pcDNA3.1载体分别进行双酶切，限制酶为EcoR I和Hind Ⅲ。酶切后将胶回收产物连接到pcDNA3.1载体上，连接后的产物在DH5α感受态细胞中进行转化，筛选单克隆提取质粒后再使用EcoR I和Hind Ⅲ酶切鉴定，在465bp处有明显的条带，与基因PCR产物的大小一致。并将该质粒送到公司测序，测得的序列在基因数据库里用BLAST对比，检测结果与预期序列一致，提示重组表达质粒pcDNA3.1-HBx构建成功。1.3Western blot检测稳转细胞内HBx蛋白的表达将构建的pcDNA3.1-HBx转染HepG2细胞，用G418（0.5μl/ml）维持筛选，以建立稳转细胞系。提取蛋白质进行免疫印迹检测，检测到HBx蛋白表达的细胞表示稳转成功。2. HBx对HepG2细胞具有促增殖作用MTT法检测各组细胞OD值发现，过表达pcDNA3.1-HBx后的HepG2细胞增殖能力明显增加，表明HBx可能对HepG2细胞具有促增殖作用。3.携带HBV全基因组的HepG2.2.15细胞增殖活性的检测MTT法检测HepG2和HepG2.2.15细胞时发现，HepG2.2.15细胞的增殖活性与HepG2无显著性差异。可能是因为HepG2.2.15中转染的是HBV的全基因组，其对细胞的增殖调节比较复杂，表现出来的是综合结果。至于真正的原因还需要进一步的研究。4. HBx蛋白对ER应激相关基因表达的影响选取ER应激相关基因，检测其在过表达HBx蛋白的HepG2细胞中的表达情况，结果发现，PERK、BiP、MANF、ATF6和XBP1在稳转HBx蛋白的HepG2细胞中表达升高，而IRE1、CHOP和EIF2则表达降低。这些结果提示，HBx蛋白能引起ER应激相关基因表达变化。考虑到MANF对HBx蛋白的反应比较敏感，接下来的实验重点研究MANF在肝炎到肝癌发展过程中的作用。5. MANF对肝癌细胞生长和迁移的抑制作用5.1过表达MANF对肝癌细胞增殖活性的影响我们前期的研究发现，在HBV感染的肝硬化中，MANF表达增加，而在HBV阳性的肝癌组织中，MANF的表达反而降低。前面的研究结果也显示，HBx可以上调MANF的表达。上述结果提示，MANF在HBV感染的肝癌中发挥一定的作用。为了澄清MANF对肝癌细胞恶性生物学行为的影响，我们首先将MANF-FLAG质粒转染到肝癌细胞中，用MTT法检测转染前后细胞活性的变化。结果发现，过表达MANF对不同类型的肝癌细胞影响不同，过表达MANF可抑制SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15细胞及稳转HBx细胞的增殖，5.2MANF siRNA的验证将MANF siRNA转染到HepG2细胞中，同时与未转染的HepG2细胞和转染空载体的HepG2细胞进行比较，其中转染MANF siRNA的HepG2细胞MANF表达量明显降低，说明MANF siRNA能有效地抑制内源性MANF的表达。5.3沉默MANF引起肝癌细胞增殖活性增加将MANF siRNA转染到SMMC-7721细胞中，同时转染空载体作为对照。转染后36h，用MTT法检测细胞的增殖活性。除此之外还检测HepG2.2.15，HepG2，HepG2-HBx等肝癌细胞系。结果发现，与转染空载体的SMMC-7721细胞比较，转染MANF siRNA的细胞增殖活性明显增加(P<0.01)，提示MANF可能对肝癌的增殖起到抑制作用。5.4沉默MANF对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响将MANF siRNA转染到肝癌细胞中，观察相关特性变化。结果发现，敲低MANF可促进SMMC-7721、HepG2.2.15及表达HBx的HepG2细胞的增殖。transwell实验也证实了转染MANF siRNA可提高肝癌细胞的迁移率和侵袭率，提示MANF对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭有抑制作用。结论：HBx可以引起HepG2细胞增值活性提高；HBx可以差异性调节ER相关基因；MANF对肝癌细胞生长、迁移和侵袭起抑制作用。