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达氟沙星(Danofloxacin,DAN)是20世纪80年代开发的一种氟喹诺酮药物,属于第三代喹诺酮类抗菌药。其抗菌谱广,可以有效抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、衣原体、支原体、螺旋体及某些厌氧菌。DAN的作用机制是通过抑制细菌DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的活性,阻碍细菌DNA的合成而致其死亡。DAN因其抑菌的广谱性和有效性,常作为饲料添加剂、疫病预防与治疗药物得到广泛应用。然而,DAN的滥用会带来一系列的副作用,如导致细菌耐药性增加和药物残留等,严重威胁人类健康和动物源食品安全。目前各国政府都对其制定了限量标准,以保证动物性食品安全和人类健康。本研究自主设计方案合成了 DAN的免疫原以免疫小鼠,并将阳性小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合后的杂交瘤细胞经“筛选-克隆-筛选-克隆-筛选-克隆-筛选”过程,共获得了 6株细胞株。将该细胞株扩充培养后进行保种并制备腹水,腹水经纯化后共获得6种高质量的抗DAN的单克隆抗体。这6种抗DAN单克隆抗体分别为3A10-A1-C6-H1、3A10-A1-C6-G9、3A10-A1-C6-H9、3A10-A1-F1-D12、3A10-B4-D2-C9 和3A10-E8-F7-H8。这些抗体的灵敏度、特异性分别通过酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行了评价。评价结果表明,3A10-A1-C6-H1的灵敏度为0.2ng/mL,3A10-A1-F1-D12 的灵敏度为 0.325 ng/mL,3A10-B4-D2-C9 的灵敏度为0.251 ng/mL,3A10-E8-F7-H8 的灵敏度为0.589 ng/mL,3A10-A1-C6-H9的灵敏度为0.27 ng/mL,3A10-A1-C6-G9的灵敏度为 0.129 ng/mL。3A10-A1-C6-H1、3A10-A1-C6-G9、3A10-A1-C6-H9、3A10-A1-F1-D12、3A10-B4-D2-C9 和 3A10-E8-F7-H8 与环丙沙星、恩诺沙星、莫西沙星、沙拉沙星及氧氟沙星均有一定的交叉反应能力。此外,基于制备的抗DAN单克隆抗体在本研究中我们开发了一种基于三角银纳米粒子(Triangle silver nanoprisms,AgNPRs)的新型等离子酶联免疫吸附法(plasmonic enzyme-linked immunosorbent assay,pELISA)检测牛奶中的DAN。近年来,pELISA已经广泛用于快速检测领域,该方法是将局部表面等离子共振(LSPR)与常规ELISA技术结合在一起。贵金属纳米粒子,尤其是金和银纳米粒子的消光系数(>08-109 M-1 cm-1)比传统ELISA底物的消光系数(例如TMB,5.9×104 M-1 cm-1)更高,因此可作为出色的信号输出载体。与其它银纳米颗粒相比,AgNPRs由于其较高的长宽比和尖锐的边缘而能产生更强的等离子体共振。因此,本章开发了基于AgNPRs作为信号输出载体的新型pELISA定性定量地检测牛奶中的DAN。该方法在0.01 M磷酸盐缓冲溶液中检测DAN的定量灵敏度为0.24 ng/mL,定性灵敏度为0.32 ng/mL,相比TMB信号输出系统,其定量定性灵敏度分别提高了 3和32倍。该方法在牛奶中检测DAN的定量灵敏度为0.96 ng/mL,定性灵敏度为1.25 ng/mL。回收率为103%-121%,与液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)相比较具有较好的一致性。综上所述,本研究制备的抗DAN单克隆抗体在免疫学检测领域还有更大的应用空间,可为食品基质中DAN残留的快速现场检测提供坚实的基础;且本文建立的pELISA方法可进一步应用于食品安全领域中其他有毒有害物质的检测,为其现场检测提供有效的快速筛查方法。