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放创复合伤多见于战时核爆炸和平时核事故,损伤后其伤口愈合主要表现为愈合过程的延迟甚至长期不愈合。尽管促进难愈性创面愈合的方法很多,如手术植皮、人工皮片应用、敷料促愈法、全身或局部药物应用、细胞因子局部应用等等,但已有的方法和措施尚存在应用上的局限性。如手术植皮中自体或异体皮来源的困难,细胞因子局部应用疗效受到药物半衰期短的影响。这迫切要求人们寻找促进放创复合难愈性创面愈合的新措施与新方法。近年来,随着细胞生物学和分子生物学的迅猛发展。创面难愈的机理研究取得了一些进展。目前的研究结果表明,引起创面难愈的原因主要有:①由于局部组织严重受损,导致局部的血液供应差,难以提供充足的营养以满足局部组织细胞再生修复的需要,导致创面迁延不愈;②局部组织细胞损伤严重,致使创面局部残留的修复种子细胞数量少,功能障碍或低下;③创面多种细胞生长因子的缺乏或降低,直接影响到局部修复细胞的分裂与增殖以及新血管生成困难。随着干细胞组织工程学的发展,干细胞移植应用为解决放射损伤后创面修复细胞数量减少和功能降低所导致创面难愈提供了新的思路。基因治疗是目前创伤促愈的重要方法之一。利用转基因干细胞移植不仅为创伤局部提供足够的修复种子细胞,而且目的基因的高效表达可弥补难愈性创面局部存在细胞生长因子的缺乏或降低,有望发展成为一条非常有前途的促进难愈性创面愈合的新途径。真皮多能干细胞是我室新近成功分离培养的一类中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞。初步研究表明这种真皮多能干细胞对创伤局部微环境的反应性明显强于成纤维细胞、血管内皮细胞等其它修复细胞,是参与皮肤创伤愈合的一种重要的组织修复细胞,且易于培养、扩增,可扩增多代而不丧失其多向分化能力。在本实验中,我们发现它对携带目的基因的质粒载体易感,能高效表达目的基因,是细胞基因治疗的良好载体。因而真皮多能干细胞不仅可作为构建组织工程化皮肤的理想种子细胞用于本研究受国家重点基础研究发展规划项目(973项目,G1999054205)及全军“十五”医药卫生基金项目(01MA166)共同资助<WP=9>大面积皮肤缺损的处理,而且可作为基因转染的载体细胞用于基因治疗及某些疾病发病机制的研究。VEGF165是血管内皮细胞生长因子家族中生物学功能最强的一个蛋白异构体,是一种分泌性糖蛋白,扩散力强,易于到达靶细胞,对血管内皮细胞的迁移、增殖、生长具有重要的促进作用;并可促进成纤维细胞的增殖、迁移;刺激局部修复细胞聚集在伤口部位,合成和分泌细胞外基质成分,具有强大的促创伤愈合作用。鉴于上述原因,我们利用真皮多能干细胞的自我复制能力与多向分化潜能,将带有增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein, EGFP)标记的真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-VEGF165转染入真皮多能干细胞,并将其扩增后局部移植入放创复合伤创面,观察其对放射损伤创面的促愈作用,探讨促进难愈性创面愈合的新途径和方法。主要结果如下:1.成功构建了真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-VEGF165提取HL-60细胞的总RNA,利用设计的VEGF165特异性引物,通过RT-PCR技术扩增出VEGF165 cDNA;琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切胶回收纯化,插入克隆载体pMD18 T vector并将其转化入工程菌DH5α,扩增后提取质粒。用EcoRI与BamHI双酶切重组克隆载体并测序分析,获得与Gene Bank报道序列一致的DNA片段;将所获得的正确片段进行琼脂糖凝胶电泳回收后插入真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点;同样转化工程菌DH5α后扩增、提取质粒,双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的片段与正确片段大小一致。2.顺利将 pIRES2-EGFP-hVEGF165转染入真皮多能干细胞运用脂质体转染的方法,将重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF165转染入真皮多能干细胞,转染后的细胞经G418筛选。转染后的真皮多能干细胞用半定量RT-PCR可检测出其VEGF165表达,扩增产物插入pMD18 T vector,测序鉴定与Genebank比较完全一致;且其表达产物与转染空载体细胞相比较,转染VEGF165细胞VEGF165的表达显著增强;荧光显微镜观察可见到真皮多能干细胞体内有报告基因产物的绿色荧光; ELISA法对VEGF的定量检测结果显示:转染后细胞VEGF分泌量约为转染空载体细胞的1.6倍;Western blotting 分析结果同样显示转染后细胞VEGF的表达明显高于转染空载体细胞;表达产物VEGF生物活性的分析证明其明显促进hECV304细胞的分裂、增殖;说明pIRES2-EGFP-hVEGF165成功地转染入真皮多能干细胞,使之表达具有生物活性的VEGF。3. 观察到转染hVEGF165真皮多能干细胞对放创复合难愈性创面具有较明显的促愈作用 <WP=10>分别将转染空载体的真皮多能干细胞与转染hVEGF165的真皮多能干细胞应用于大鼠放创复合难愈性创面,观察其对难愈性创面的促愈效果。对比分析,转染hVEGF165真皮多能干细胞治疗组大鼠放创复合伤创面于伤后21-22天愈合,转染空载体细胞对照组于伤后24-26天愈合,而生理盐水对照组于伤后26-28天愈合。同时分析伤后1、3、7、14、21天创面的残留面积显示,伤后7天开始,实验治疗组与对照组有显著性差异,而创面的微血管计数结果也显示相同的趋势。结果表明创面局部移植转染hVEGF165的真皮多能干?