论文部分内容阅读
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的重要植物病原真菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物的维管束萎蔫病害，了解它的致病分子机理对植物维管束萎蔫病害的有效防治具有重要意义。显然，通过致病相关基因的鉴定是达到这一目标的关键所在。许多致病相关基因是通过DNA插入突变产生致病缺陷突变而分离得到的。限制酶介导整合转化(restriction enzyme-mediated integration，REMI)正被越来越多地应用于丝状真菌致病相关基因的标记与克隆。另外，近年来农杆菌介导的DNA转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation，ATMT)也开始应用于一些丝状真菌的转化。 本研究较系统地对尖孢镰刀菌的REMI转化体系进行了优化，并对部分转化子的表型进行了初步的分析。研究结果表明尖孢镰刀菌菌体的培养时间、胞壁降解酶的种类、酶解时间和温度、再生培养基等一系列因素对原生质体释放及再生有明显的影响。根据研究结果总结出一套有效的尖孢镰刀菌原生质体制备的方法：从PDA固体培养基上培养8天的菌落上洗下尖孢镰刀菌孢子，将孢子按浓度7.4×10~7～1.0×10~8个／100ml接种到PDB液体培养基中，27℃下振荡培养11～13个小时，过滤洗涤收集菌丝，然后用12mg／ml溶壁酶和4mg／ml蜗牛酶组成的混合酶在33℃、80rpm的条件下酶解4～5个小时，过滤、洗涤、收集原生质体。一般300ml菌丝培养液可以得到3ml左右、浓度为5.0×10~7～1.44×10~8个／ml的原生质体。通过对比实验表明，不同的质粒和限制性内切酶的种类对尖孢镰刀菌的REMI转化效率也有较明显的影响。在相同实验条件下，pCB1004质粒的REMI转化效率比pCB1003的高；用内切酶BamH Ⅰ介导的转化效率也比Hind Ⅲ的高。实验结果还表明，REMI的转化效率是一般质粒转化效率的19.12～22.72倍。 本文利用限制酶介导DNA插入突变(REMI)转化尖孢镰刀菌黄瓜专化型代表菌株ATCC16416，共获得了123个尖孢镰刀菌转化子。对以上所得的123个转化子进行生长速度及产孢量的初步测定，发现产孢量比ATCC16416降低了1～4.5倍的有13个转化子，产孢量升高了1.35～3.59倍的有12个转化子。对所 浙江大学硕士学位论文有转化子在PDA上生长速度的测定结果显示，其中10个转化子的生长速度比ATCCI 6416有不同程度的减慢。对以上生长速度变慢的10个转化子做了初步的致病性分析，发现H60和52两个转化子的致病性变弱。 本文还构建了1个适用于丝状真菌农杆菌介导转化(ATMT)和基因突变的双元载体AfMTI。该质粒是在pCAMBIA1300质粒的基础上构建的，其关键之处是用仰C启动子代替了355(CaMN35S)启动子，使之适合丝状真菌的转化。