水稻是我国的主要粮食作物之一,通过转基因育种方法增强水稻自身的抗性为病虫害防治提供了的高效的解决途径。目前我国已经研发出一系列转Bt基因水稻,正处在批准商业种植的关键时期,环境安全性和食品安全性评价工作十分紧迫。近年来,就一些转基因抗虫水稻品系的基因漂流,靶标害虫的抗性风险,对非靶标生物和稻田节肢动物群落的影响以及毒蛋白在土壤中的残留等方面已经取得了长足进展,为转基因水稻的环境安全性评价积累了一定的经验和技术。转Bt基因水稻环境风险评价的核心是追踪外源蛋白的环境行为、以及外源蛋白的生态学效应。本论文以华中农业大学研发了转cry1Ab/1Ac基因和转cry2A基因水稻为材料,开展了四部分的研究工作,(1)建立了以二化螟为敏感靶标的外源蛋白环境持留期的生活测定技术,并与ELISA测定的结果进行了对比研究,(2)外源蛋白在以敏感靶标和非敏感靶标为节点的食物链中的传递,以及对第三营养级(天敌)的影响,(3)外源蛋白在水生食物链中的传递及其生物学效应,(4)Bt稻和非Bt稻秸秆的腐烂过程研究及其过程中的细菌和真菌多样性差异研究。主要结果如下:1.Bt稻外源蛋白在秸秆残体中的环境持留期的生物测定黄熟期转cry1Ab/1Ac和cry2A基因水稻秸秆对二化螟(Chilo suppressalis Walker)初孵幼虫的致死率分别为85%和73%,此时ELISA测定结果显示两种秸秆中的Bt蛋白含量分别约为4700 ng/g(鲜重)和2800 ng/g(鲜重)。将黄熟期的两种秸秆添加入人工饲料后的致死率分别为46%和35%(1000g人工饲料添加30g干重)。在此基础上设置一系列的Bt秸秆添加量(从30g至0.375g),结果显示以二化螟死亡率作为指标对Bt秸秆添加量的反应极限为7.5g/1000g人工饲料,以二化螟体重抑制率作为指标对Bt秸秆添加量的反应极限为0.75~0.375g/1000g人工饲料,生长抑制率比致死率对秸秆中Bt外源蛋白的反应灵敏度高出20-40倍。通过换算得出二化螟生长抑制率对秸秆残体中Bt外源蛋白的检测下限约为10ng/g左右。用ELISA方法测得的外源蛋白在Bt稻秸秆中的半衰期约为9 d至17 d,90%衰减期接近80 d;用二化螟为靶标生物的生测结果发现,Bt水稻秸秆中的外源蛋白半衰期约为5 d至10 d,90%衰减期为13 d至20 d。生测得出的外源蛋白环境持留期要远远短于ELISA测定的结果,因此,随秸秆残体持留在环境中的Bt外源蛋白的环境风险要比原来估计的低很多。2.Bt稻外源蛋白在以敏感和非敏感靶标为节点的食物链中的传递和生物学效应研究了Bt水稻对三种植食性昆虫(二化螟C.suppressalis Walker、粘虫Mythimna separate Walker及褐飞虱Nilaparvata lugens St?l)生长发育影响,取食Bt稻的二化螟的存活率及体重增长显著低于对照(p<0.05),而粘虫和褐飞虱对Bt稻不敏感,存活率及体重增长与对照相比没有显著性差异。分别用取食Bt稻嫩苗的三种植食性昆虫饲喂饥饿处理后的狼蛛(Lycosa pseudoamulata),检测对狼蛛生长发育的影响,结果显示捕食取食Bt稻的二化螟处理组的狼蛛存活率和体重显著低于对照,而捕食取食Bt稻的粘虫和褐飞虱的狼蛛存活率和体重与对照相比无显著差异。测定了Bt蛋白沿食物链传递的并在第二级和第三级营养级中的富集情况,结果显示在三种植食性昆虫体内都检测到了Bt蛋白,浓度分别为40 ng/g、45 ng/g和25 ng/g,在天敌狼蛛体内也检测到了微量的Bt蛋白,浓度分别为9 ng/g、6 ng/g和8 ng/g。综合以上结果可以看出,转Bt水稻可以对第三营养级(即天敌)造成负面影响,也可以对第三营养级没有负面影响,关键在于第三营养级捕食的是Bt稻的敏感靶标还是非敏感靶标。通常情况下,自然界中天敌除捕食Bt稻的敏感靶标外还捕食Bt稻敏感靶标,从这种意义上说Bt水稻对天敌是安全的。3.Bt稻外源蛋白在水生食物链中的传递及其生物学效应本试验研究了Bt稻外源蛋白沿着食物链“水稻-大型溞Daphnia magna-斑马鱼Brachydanio rerio”及“水稻-小龙虾Procambarus clarkii”的传递规律及生物学效应,并分析了Bt稻对大型溞、斑马鱼及小龙虾生长发育及体内三种保护酶的影响,最后用ELISA方法检测每级营养级生物中的Bt蛋白富集量。结果显示,用Bt稻饲喂的大型溞的存活率、产卵量及体内三种保护酶活性与对照相比没有显著性差异(p>0.05);用培养Bt稻后的培养液培养大型溞、饲喂饥饿处理的斑马鱼10天后,转基因处理组斑马鱼的存活率、体长及体内的保护酶活性相比对照处理没有显著性差异(p>0.05);用Bt稻苗直接饲喂的小龙虾8周内的存活率、体重增长、体长增长、体内保护酶活性相比对照常规处理没有显著性差异(p>0.05),并与鱼饲料对照处理也无显著性差异(p>0.05)。大型溞体内检测到的Bt蛋白浓度约为50 ng/g,斑马鱼体内检测到的Bt蛋白浓度约为11 ng/g,小龙虾肠道体内检测到的Bt蛋白浓度约为5 ng/g。从以上结果可以看出Bt稻对这些水生生物是安全的。4.Bt稻和非Bt稻秸秆腐烂特性及其过程中的微生物多样性的差异转基因抗虫水稻秸秆还田后与常规秸秆相比在腐烂特性有无差异是环境风险评价的重要内容之一。本试验以转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的明恢63水稻秸为材料,在田间与常规非转基因明恢63秸秆的腐烂速率进行了比较,通过二代测序的方法比较了转基因与非转基因秸秆中的微生物(包括细菌和真菌)的多样性。结果表明,两个转基因品系的秸秆在各时期的残重、含碳量、含氮量以及碳氮比均无显著差异,但转基因品系和非转基因品系之间,以及转cry1Ab/1Ac和cry2A基因的明恢63水稻之间细菌和真菌的种类和多样性出现可检测到的差异,这些微生多样性的差异可能是由于Bt外源蛋白引起的,也可能是由于转基因事件本身引起的,但本研究的结果可以确定微生物组成的微小差异并未影响到秸秆的腐烂矿化过程。