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目的:本研究通过免疫组织化学(Immunohistochemical,IHC)方法分析细胞质激活/增殖相关蛋白-1(Caprin-1)在肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)临床样本中的表达情况,并应用癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析Caprin-1表达与HCC患者预后的相关性,在此基础上利用超声靶向微泡破坏(UTMD)介导Caprin-1敲除质粒(Caprin-1-KO)转染人肝癌HepG2细胞,观察转染目的质粒后对人肝癌HepG2细胞增殖、周期、侵袭及迁移等生物学特性的影响,探讨Caprin-1在HCC发病机制中的作用及其与HCC临床病理特征和预后的关系,为HCC预后评估及超声介导基因靶向治疗提供新的思路。方法:1.通过IHC检测HCC组织与正常肝组织中Caprin-1表达的差异。2.下载TCGA数据库中154例HCC患者的临床资料,分析Caprin-1表达与患者临床病理学特征相关性,评估Caprin-1表达水平与HCC患者预后之间的关系。3.构建Caprin-1敲除质粒Caprin-1-KO-1、Caprin-1-KO-2,通过测序确认重组质粒。4.Cell Counting Kit-8(CCK8)法检测人肝癌HepG2细胞在不同浓度六氟化硫(SF6)微泡作用下细胞活性变化,探索出最适微泡浓度应用于后续实验。5.在上述最适微泡浓度的基础上,利用UTMD法介导Caprin-1敲除质粒转染人肝癌HepG2细胞进行更多参数摸索,包括辐照时间、机械指数(MI),筛选出后续细胞实验最优超声转染条件。6.利用最优超声转染条件将目的质粒转染入人肝癌HepG2细胞,用Western Blot法检测Caprin-1蛋白的表达情况,筛选出后续细胞功能实验所用的最优质粒。7.转染最优质粒抑制人肝癌HepG2细胞Caprin-1表达后,CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期情况,Transwell法检测细胞侵袭情况,划痕实验(Woundhealing法)检测细胞迁移情况。结果:1.免疫组织化学分析显示HCC组织中Caprin-1的表达水平显著高于正常肝组织,差异有统计学意义(P<0.05)。2.使用组织芯片(Tissue Microarray,TMA)临床数据分析Caprin-1与患者的临床特征相关性时,结果显示Caprin-1高表达与临床分期晚期,肿瘤侵袭能力增强的HCC患者相关,差异有统计学意义(P<0.05);通过TCGA数据库进一步分析显示,Caprin-1高表达与年龄及肿瘤浸润程度有关(P<0.05),Kaplan-Meier分析显示Caprin-1高表达的肝癌患者的总生存率和无病生存率显著短于Caprin-1低表达的患者,差异有统计学意义(P<0.05),而在未发生转移的患者中,Caprin-1高表达患者的非转移生存率及无病生存率明显低于Caprin-1低表达的患者,差异均有统计学意义(P<0.05);Cox比例风险回归模型的单变量分析比较和多变量生存比较显示Caprin-1高表达可以作为HCC显著的独立预后因素(P<0.05)。3.设计Caprin-1敲除质粒Caprin-1-KO-1、Caprin-1-KO-2引物序列,插入PX330-puro质粒载体酶切的限制性内切酶Bsmb1位点,提取质粒经过电泳及测序,鉴定质粒Caprin-1-KO-1、Caprin-1-KO-2构建成功。4.微泡浓度实验表明:微泡浓度小于或等于5%时,细胞存活率在80%以上,随着微泡浓度的不断上升,细胞存活率开始下降,浓度上升至10%时,细胞开始出现毒性反应,当浓度为20%时,细胞存活率低于<70%,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。本实验按照既不影响细胞活性,又最大程度提高转染率的原则,将5%微泡浓度应用于后续实验研究。5.UTMD介导Caprin-1敲除质粒转染人肝癌HepG2细胞的参数优化:(1)与空白细胞对照组、单纯质粒组、微泡+质粒组对比,微泡+质粒组+超声辐照组转染率最高,差异具有统计学意义(P<0.05);(2)当微泡浓度为5%时,随着MI值的升高,各组转染率出现先增高后下降变化,差异有统计学意义(P<0.05);当微泡浓度为5%,辐照时间20s,MI为0.37时的基因转染率最高,达(24.15±1.75)%,与其他组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。6.在最优超声转染条件下转染目的质粒后,Western Blot法检测Caprin-1的蛋白表达情况示:与阴性对照组(NC)、Caprin-1-KO-1组对比,Caprin-1-KO-2组转染进入细胞后Caprin-1表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。7.UTMD法介导Caprin-1-KO-2(后文命名为Caprin-1-KO)转染人肝癌HepG2细胞,抑制Caprin-1表达后,HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移均受到抑制,与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05);并且实验组GO/G1期细胞(64.56±1.20)%较对照组(43.11±2.14)%明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05),提示细胞周期受到阻滞。结论:1.Caprin-1在HCC组织中高表达,并与HCC的临床分期晚期、肿瘤侵袭能力增强等不良预后相关联,可作为HCC独立的预后因素,表明Caprin-1有可能成为HCC患者基因治疗新的分子靶标。2.人肝癌HepG2细胞的存活率与微泡浓度成反比,UTMD法可增强基因转染,当在条件为微泡浓度5%,MI 0.37,辐照时间为20s时进行辐照,基因转染率最高。3.UTMD法介导Caprin-1-KO转染人肝癌HepG2细胞,抑制Caprin-1表达后,HepG2细胞的增殖、侵袭和迁移受到抑制、细胞周期发生阻滞,为进一步探讨Caprin-1在HCC发病机制中的潜在作用及临床意义提供依据。