研究背景和目的卵巢癌(ovarian carcinoma, OC)是最常见的女性恶性肿瘤之一,占女性生殖道肿瘤致死率的第一位,女性一生中患卵巢癌的可能性约1.4%。卵巢癌治疗目前以手术治疗为主,但大多数卵巢癌患者确诊时已经是中晚期,对卵巢癌化疗药物不敏感。卵巢癌近20年来进展缓慢,从早期诊断到治疗方案尚不明确,因此有必要阐明其发病机制,寻找有效的卵巢癌肿瘤标志物,用于卵巢癌的预后判断及新药研发,从而降低卵巢癌的死亡率和提高生存率。CXXC锌指蛋白5(CXXC finger protein 5, CXXC5),又名RINF(retinoid-inducible nuclear factor),属于CXXC锌指蛋白区域家族,是定位于5号染色体长臂5q31.3的35.5 KD大小的蛋白,编码维甲酸诱导的细胞核因子。最近的研究表明CXXC5参与多种生物学过程,包括细胞分化、细胞凋亡、内皮细胞侵袭和能量代谢等。因此,CXXC5在人类多种疾病中扮演了重要的角色。目前CXXC5在肿瘤中的研究处于初始阶段,S.Knappskog et al.发现同正常对照组织相比,CXXC5的表达在原发性乳腺癌、甲状腺癌和转移性黑素瘤中高表达,且在乳腺癌中CXXC5的高表达同总生存期短相关。他们使用同时提供生存和CXXC5mRNA水平数据的独立基因表达芯片进一步证实CXXC5的表达水平独立于三苯氧胺的预后因素。高水平的CXXC5与野生型TP53显著相关,提示CXXC5可能代替TP53突变作为乳腺癌发生发展的致癌机制。然而目前CXXC5与卵巢癌之间的关系及其在发生发展中作用机制少有研究探讨。本文旨在通过研究CXXC5的表达情况与卵巢癌临床特征之间的关系及观察其对卵巢癌细胞系增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭等生物学功能的影响达到提高上皮性卵巢癌预后和靶向治疗的目的。方法1、GEO和TCGA数据库对CXXC5在上皮性卵巢癌中的表达分析利用基因表达汇编(Gene Expression Omnibus, GEO)和肿瘤基因图集(TheCancer Genome Atlas,TCGA)数据库对CXXC5在上皮性卵巢癌中的表达进行分析处理。2、CXXC5在卵巢癌及正常对照组织中的表达及临床意义通过免疫组化方法检测CXXC5在上皮性卵巢癌组织芯片中的表达情况并使用X2检验及t检验方法对CXXC5与临床病理特征之间的关系进行分析。3、CXXC5在卵巢癌细胞中的生物学功能1)利用Lipofectamin2000TM转染试剂介导pEZ-Lv105-CXXC5质粒和空载pLKO.1分别转染OVISE卵巢癌透明细胞株和NIHOVCAR3浆液性卵巢癌细胞株,利用Lipofectamin2000TM转染试剂介导pEZ-Lv105-shCXXC5质粒和空载pLKO.1分别转染ES-2卵巢癌透明细胞株和COV504浆液性卵巢癌细胞株。2)利用RT-PCR和Western blot方法鉴定转染后CXXC5蛋白在细胞中的表达情况。3)使用CCK8方法测定同对照组相比干扰、过表达后细胞增殖能力的改变。4)平板克隆形成实验进一步验证CCK8方法得到的结果。5)利用transwell空穿和胶穿方法检测同对照组相比干扰、过表达后细胞迁移和侵袭能力的变化。6)采用流式细胞仪检测同对照组相比干扰、过表达后细胞凋亡和细胞周期变化。7)通过裸鼠皮下成瘤实验从体内的角度验证CXXC5干扰、过表达对肿瘤增殖活性的影响。4、CXXC5可能影响卵巢癌增殖的分子学机制利用Western blot法检测卵巢癌细胞株CXXC5过表达和干扰前后Src,Akt,Erk1/2信号通路中相关蛋白磷酸化与非磷酸化形式。结果1、CXXC5在GEO数据库提供的卵巢癌数据中高表达,与卵巢癌进展密切相关通过Pubmed中GEO数据库提供的基因芯片分析了CXXC5在12对卵巢正常表面上皮细胞和卵巢癌上皮细胞中的mRNA表达水平,结果发现与卵巢正常表面上皮细胞相比,CXXC5在卵巢癌上皮细胞中高表达,差异具有统计学意义(GSE14407,P=0.00159)。分析了CXXC5在小鼠卵巢表面上皮细胞在早、中、晚期由癌前/非恶性向恶性/侵袭性的发展转变。得出卵巢癌进展密切相关(GSE24789,早期vs中期P=0.0216；早期vs晚期P=0.0281；中期vs晚期P=0.0867)。分析了CXXC5在10株卵巢癌细胞系中的mRNA表达情况,结果发现CXXC5在透明性卵巢癌细胞中普遍高表达,差异具有统计学意义(GSE3001,P=0.0186)。分析CXXC5在ER+和ER-上皮性卵巢癌中的mRNA表达情况,结果提示CXXC5在ER+的卵巢癌细胞系中的表达水平(9.477±0.260)显著高于ER-的卵巢癌细胞系表达水平(7.045±0.298),差异具有统计学意义(GSE22600,P=3.22481E-10)。2、CXXC5在TCGA数据库提供的高级别浆液性卵巢腺癌中以扩增为主分析TCGA数据库中提供的489例高级别浆液性卵巢腺癌发现CXXC5在多种肿瘤基因组中的表达以突变和扩增为主,而在高级别浆液性卵巢腺癌基因组中以扩增为主。3、CXXC5在卵巢癌组织中高表达构建了含有173例卵巢癌和37例卵巢良性囊肿样本组织芯片,应用免疫组化法检测CXXC5在卵巢癌组织和良性卵巢良性囊肿组织中的表达情况。CXXC5在正常卵巢对照组织中高表达率(13.5%)明显低于在卵巢癌组织中的高表达率(39.3%)(图3-4-2),差异有显著性(P=0.003)。以上结果充分表明CXXC5在卵巢癌中表达显著增高。4、CXXC5与卵巢癌组织学类型及淋巴结转移密切相关在173例卵巢癌组织样本中,年龄≤50岁的有67例,高表达22例(32.8%)；年龄>50岁的有106例,高表达的46例(占43.4%)；两者之间不具有统计学差异(P==0.166),提示CXXC5的高表达与卵巢癌患者的年龄无关。检测CXXC5高表达水平,发现浆液性卵巢癌93例,高表达40例(43.0%),黏液性卵巢癌48例,高表达11例(23.0%),内膜样卵巢癌17例,高表达7例(42.2%),透明细胞卵巢癌15例,高表达10例(66.7%),四者之间的差异具有统计学意义(P=0.014),提示CXXC5的表达与卵巢癌患者的组织学类型密切相关。发生淋巴结转移的患者有15例,高表达15例(60%)；未发生淋巴结转移的患者有148例,高表达53例(35.8%),两者间差异具有统计学意义(P=0.022),提示CXXC5的表达与卵巢癌患者的淋巴结转移密切相关。按照FIGO分期中Ⅰ期74例,高表达24例(32.0%)；Ⅱ期高表达12例(42.9%);Ⅲ期高表达28例(45.2%)；Ⅳ期高表达4例(50%),四者间差异不具有统计学意义(P=0.376),提示CXXC5的表达水平与卵巢癌患者的FIGO分期无关。以上结果表面CXXC5与卵巢癌组织学类型及淋巴结转移密切相关,由此推测CXXC5可能可以作为上皮性卵巢癌组织学分类的生物学标志物,并可能是一个提示卵巢癌的预后不良的重要标志物。5、CXXC5促进体内外卵巢癌增殖活性利用质粒转染技术,对卵巢癌细胞株进行CXXC5过表达干扰处理以探讨其生物学的功能。运用CCK8检测细胞的增殖能力,结果显示干扰CXXC5后,卵巢癌透明细胞株ES-2的增殖能力明显减弱,在24、48、72和96小时,shl组与对照组相P值分别为0.838、0.033、0.006和0.042;sh2组与对照组相比P值分别为0.018、0.0049、0.005和0.003。过表达CXXC5后,卵巢癌透明细胞株OVISE的增殖能力明显增强,在24、48、72和96小时,过表达组与对照组相比P值分别为0.00126、2.02891E-07、6.82229E-06和6.64982E-05。利用平板克隆形成实验进一步证实了CXXC5促进体外卵巢癌细胞增殖活性这一结果。将干扰CXXC5的ES-2细胞与对照细胞分别接种到裸鼠皮下以观察裸鼠皮下瘤增殖的能力,结果表明对照细胞组皮下瘤重量2.298±0.587 g,体积1.467±0.377 cm3,干扰细胞组皮下瘤重量为0.346±0.319 g(P=0.00054),体积为0.0445±0.0204 cm3(P=0.00105),两者具有统计学意义。相反地,将过表达CXXC5的OVISE细胞与对照细胞分别接种到裸鼠皮下以观察裸鼠皮下瘤增殖的能力,结果表明对照细胞组皮下瘤重量0.336±0.270 g,体积0.0422±0.0260cm3,过表达细胞组皮下瘤重量为2.192±0.754 g(P=0.00434),体积为2.194±0.833 cm3(P=0.00442),两者具有统计学意义。上述结果证实CXXC5促进体内卵巢癌细胞增殖活性。6、CXXC5抑制卵巢癌细胞凋亡的发生使用流式细胞仪检测过表达和干扰CXXC5后细胞凋亡分布出现变化,结果表面ES-2细胞对照组凋亡率(5.007±0.342)%,CXXC5-sh1组凋亡率(8.173±1.344)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.0478)；CXXC5-sh2组凋亡率(12.483±2.157)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.0243)。OVISE细胞对照组凋亡率为(3.617±0.200)%,Lenti-CXXC5组凋亡率为(2.910±0.332)%,与对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.0448)。以上结果表明,CXXC5抑制卵巢癌细胞凋亡的发生。7、CXXC5对卵巢癌细胞周期无诱导作用利用OVISE细胞系转染了过表达CXXC5的质粒后,通过流式细胞术分析透明细胞卵巢癌系的细胞周期分布情况。结果表明,对照组细胞系G0/G1期(54.300±0.167)%,S期(33.627±0.086)%,G2/M期(12.180±0.115)%；与对照组相比较,过表达组细胞系G0/G1期(51.720±0.183)%,S期(34.620±0.177)%,G2/M期(13.517±0.116)%,比例未发生明显改变,差异无统计学意义。所以,CXXC5对卵巢癌细胞周期无诱导作用。8、CXXC5增强卵巢癌细胞迁移和侵袭能力利用稳定干扰CXXC5的ES-2卵巢癌透明细胞株与对照组细胞进行空穿实验,结果表明ES-2干扰组shl细胞数(106±16)明显少于空载对照组细胞(259±18),P值为2.17022E-08,两者比较差异有显著性；ES-2干扰组sh2细胞数(102±±14)明显少于空载对照组细胞(259±±18),P值为1.58984E-08,两者比较差异有显著性。利用稳定干扰CXXC5的ES-2卵巢癌透明细胞株与对照组细胞进行胶穿实验,结果表明ES-2干扰组shl细胞数(9±2)明显少于空载对照组细胞(20±±4),P值为0.0030；两者比较差异有显著性；ES-2干扰组sh2细胞数(6±1)明显少于空载对照组细胞(20±±4),P值为0.0012,两者比较差异有显著性。上述结果充分说明CXXC5具有促进卵巢癌细胞系的体外迁移和侵袭的能力。9、CXXC5激活Src,Akt,Erk1/2信号通路基于上述研究结果,进一步探讨了CXXC5调节卵巢癌细胞的增殖、凋亡的分子机制。利用免疫印迹实验方法检测CXXC5对Src,Akt,Erkl/2信号通路相关蛋白表达水平的影响。干扰CXXC5后Akt,Src,FAK和Erk/2的磷酸化蛋白水平显著降低,而总的蛋白水平维持不变。相反地,过表达CXXC5后Akt,Src,FAK和Erkl/2的磷酸化蛋白水平显著增加,而总的蛋白水平维持不变。以上结果充分说明CXXC5通过激活Src,Akt,Erk1/2信号通路调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡。结论1、CXXC5可能是一个上皮性卵巢癌的预后不良的重要标志物。2、CXXC5能在体内外促进卵巢癌细胞的增殖活性。3、CXXC5能增强卵巢癌细胞迁移和侵袭能力；抑制卵巢癌细胞凋亡的发生。4、CXXC5可能通过激活Src, Akt, Erk1/2信号通路调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡。