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[背景]由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)引起的泌尿生殖道感染是目前国内外发病率最高、并发症众多、病程反复难愈的一类性传播疾病(Sexually transmitted diseases,STDs)。据美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)对生殖道沙眼衣原体感染的统计,2018年女性衣原体感染率为692.7/100000,男性衣原体感染率为380.6/100000,女性衣原体感染率是男性的两倍。由于大多数Ct感染者无明显症状,Ct引起的最初损害往往被忽视,尤其是对于感染率更高的女性来说更是可以引起严重并发症,如盆腔炎,异位妊娠等。近年来,抗生素治疗Ct感染的有效抑制率显示出降低的趋势。虽然有相关动物模型和人体研究表明疫苗是可行的,但目前还没有关于针对治疗Ct感染有效疫苗的报道。噬菌体疗法在临床上用作治疗慢性、持续性或抗生素抵抗的细菌感染已有多年的历史,但目前针对Ct的特异噬菌体还尚未被发现。本实验室前期研究发现豚鼠包涵体性结膜炎衣原体(Guinea Pig Inclusion Conjunctivitis Chlamydia,GPIC)噬菌体PhiCPG1衣壳蛋白VP1对体内外沙眼衣原体感染均有显著的抑制效应。我们通过Inter Pro网站预测到了VP1蛋白上第18-476位氨基酸位点是VP1蛋白的功能结构域并构建出了VP1功能结构域截短蛋白VP1C,发现其对E型Ct抑制效果明显优于VP1蛋白。同时,也在天津医科大学总医院性病门诊Ct泌尿生殖道感染病人的临床标本中筛选出了Ct特异噬菌体衣壳蛋白VP1可能的基因序列,与目前已发现的6种衣原体噬菌体衣壳蛋白VP1的基因序列比对结果显示相似度可达97%-99%。[目的]设计构建出一种针对Ct具有高效且特异抑制作用的重组蛋白,为Ct感染治疗抵抗探索新的解决方法。[方法]分别诱导含有6His-VP1-pET30a(+)和6His-VP1C-pET28a(+)的重组质粒的大肠杆菌大量表达出保持结构和功能的VP1和VP1C蛋白;用带Ni~+的His.Bind亲和树脂纯化重组蛋白并通过梯度透析复性,SDS-PAGE凝胶电泳及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)鉴定重组蛋白的表达及纯化;将纯化后的VP1、VP1C蛋白和杆菌肽分别与八种不同血清型Ct(D、E、F、G、H、I、K、L1)标准株于室温下预孵育3h后接种至Hela细胞,同时设置八种Ct感染对照组,48h后间接免疫荧光染色计数包涵体;将临床标本中筛选出的沙眼衣原体特异噬菌体衣壳蛋白VP1可能的基因序列与PhiCPG1衣壳蛋白VP1基因序列进行BLAST比对找出差异基因位点。在VP1C蛋白基因片段的基础上改变上述差异基因设计出VP1Cm蛋白的基因序列;利用基因合成的方法构建重组质粒6His-VP1Cm-pET28a(+)并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经抗生素抗性平板筛选,内切酶双酶切鉴定及核苷酸序列测定验证重组VP1Cm蛋白基因;VP1Cm蛋白的表达纯化与鉴定过程同上;BCA蛋白定量法测蛋白浓度;CCK-8法测定一系列稀释浓度的VP1、VP1C、VP1Cm蛋白及杆菌肽对Hela细胞的细胞毒性并由此所得结果确定后续实验最适干预浓度范围;将相同浓度的VP1、VP1C、VP1Cm蛋白、杆菌肽及PBS溶液分别与E型Ct标准株于室温下预孵育3h后接种至致密单层的Hela细胞中,同时设置E型Ct感染对照组,48h后间接免疫荧光计数包涵体数,比较VP1、VP1C和VP1Cm蛋白对E型Ct的抑制作用;分别将相同浓度的VP1、VP1C、VP1Cm蛋白和杆菌肽与淋球菌菌液混合后均匀涂布至巧克力平板,48h后计数菌落数,观察VP1、VP1C、VP1Cm蛋白及杆菌肽对淋球菌生长的影响。[结果]在相同干预浓度时,功能结构域截短蛋白VP1C蛋白对八种不同血清型Ct的抑制作用均优于PhiCPG1衣壳蛋白VP1(P均<0.0001)。VP1蛋白对八种血清型Ct抑制率分别为:78.19%,76.20%,77.89%,62.55%,64.60%,85.10%,73.97%,72.14%。VP1C蛋白对八种血清型Ct抑制率分别为:94.63%,85.13%,86.21%,81.46%,75.20%,89.64%,79.69%,74.91%。杆菌肽对八种不同血清型Ct抑制作用均不明显(P均>0.05);在VP1C基因序列基础上成功设计出VP1Cm基因序列,并成功表达纯化出VP1Cm蛋白;在相同浓度时,蛋白VP1、VP1C和VP1Cm对E型Ct的抑制率分别为76.20%、85.13%和90.01%,蛋白VP1Cm对E型Ct的抑制作用优于蛋白VP1(P<0.0001)和VP1C(P<0.01);杆菌肽对淋球菌有明显抑制作用(P<0.0001),而蛋白VP1、VP1C和VP1Cm对淋球菌没有明显抑制作用(P均>0.05)。[结论]功能结构域截短蛋白VP1C相较于PhiCPG1衣壳蛋白VP1对Ct抑制作用的优势具有普遍性;经设计过的蛋白VP1Cm对Ct的抑制作用明显优于蛋白VP1及VP1C;蛋白VP1、VP1C和VP1Cm对Ct的抑制作用具有特异性。