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背景三十年前,Poiese等从人皮肤T细胞淋巴瘤患者的淋巴细胞中分离出来人类T细胞白血病1型病毒(Human T-cell Leukemia Virus Type1, HTLV-1), HTLV-1是人类历史上第一个被发现的人类逆转录病毒,它是引起成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia, ATL)的病原体,CD4+、CD8+T细胞和树突状细胞是HTLV-1攻击的主要靶细胞。目前全世界该病毒的携带者约1000万～2000万,大约有2%～5%的感染者发展为ATL,可以采用多种方法对ATL进行治疗,但急性ATL的存活期平均不超过一年。尽管ATL的生存期很短,但从HTLV-1感染到发展为ATL需要大约20-40年的潜伏期。那么,在如此漫长的潜伏期中,HTLV-1与宿主的免疫系统是如何较量呢?尚不完全清楚,如果能真正阐明宿主细胞和HTLV-1之间的相互作用机制,就可以找到合适的靶点对HTLV-1感染者进行干预,从而阻止ATL的发生。高迁移率组蛋白1(High Mobility Group Boxl, HMGB1)是一种高度保守的核蛋白,还是一种胞外损伤相关分子模式(Damage Associated Molecular Patterns, D AMPs),在细胞外具有细胞因子的功能,可以启动天然和获得性免疫过程,参与包括病毒在内的病原体引起的感染和自身免疫等急慢性炎症过程。近来人们发现,HMGB1可以和Beclin-1(自噬关键蛋白之一)结合,参与细胞自噬(Autophagy)的调节。在之前的研究中,我们已经证明HMGB1可以促进HTLV-1感染的T细胞中病毒的复制,但其促进HTLV-1复制的作用机制仍不明确。目的探讨HMGB1对HTLV-1感染T细胞自噬的影响,研究HMGB1促进HTLV-1病毒复制的机制。研究HMGB1、HTLV-1病毒感染的细胞自噬和HTLV-1病毒复制三者之间的关系。方法1、细胞培养：MT2、HeLa细胞分别培养于含有15%、10%灭活的胎牛血清和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、25mM Hepes、2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中,在含有5%的CO2培养箱中培养。每2天换液1次,调整细胞密度不超过1×106/mL；2、质粒构建：pmCherry-LC3荧光质粒,pHTLV-1-LTR-pEGF;以LC3-EGFP为模板扩增LC3全长,纯化回收后,酶切4h,再次纯化回收后,插入pmCherry-C1,挑取阳性克隆测序验证。pHTLV-1-LTR-pEGF由美国Pittsburgh大学Xiao Gutian博士馈赠。3、细胞转染：用lipofectamine2000将pmCherry-LC3质粒DNA和HTLV-1-LTR质粒DNA共转染入HeLa细胞,同时转染各自的空载体质粒DNA作为对照,4-6h后更换新的培养基并加入一定数量MT2(MT2:HeLa=1：2的数量比)细胞共培养,12h后移除MT2细胞,加入新鲜培养基并加入相应的药物,作用36h后,共聚焦显微镜观察HELA细胞感染HTLV-1病毒情况以及自噬关键蛋白LC3的表达及分布；4、药物处理：使用1μg/mLNaCl、1μg/mL重组人高迁移率组蛋白1(rhHMGB1)、3nM雷帕霉素(Rp,自噬诱导剂)、1μg/mL rhHMGB1+3nM Rp、5mM3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制剂)、5mM3-MA+1μg/mLrhHMGB1、200μM甘草酸(GA, HMGB1释放抑制剂)、1μg/mL HMGB1抗体(HMGB1特异性中和剂)、1μg/mL IgG抗体(排除HMGB1抗体组的非特异性干扰)处理MT2和HeLa细胞,使用不同方法检测相关分子的变化情况；5、指标检测：在NaCl、rhHMGB1、Rp等药物处理MT2细胞后,Western blot检测p62、LC3、p19等蛋白的表达情况；电子显微镜观察自噬泡；质粒共转染及NaCl、 rhHMGB1、Rp等药物处理HeLa细胞后共聚焦显微镜观察HeLa细胞感染HTLV-1病毒情况以及自噬关键蛋白LC3的表达及分布情况；6、统计学分析：应用SPSS17.0统计软件进行数据处理和分析,实验结果以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,两组均数比较用t检验,p<0.05为差异有统计学意义。结果1、成功构建真核表达质粒pmCherry-LC3;2、电镜结果：rhHMGB1处理MT2细胞后,与对照组相比,细胞质中自噬小体数量明显增多,但是当使用HMGB1释放抑制剂GA和特异性中和抗体处理细胞之后,与rhHMGB1处理组相比,自噬小体的数量明显下降；3、Western blot结果：rhHMGB1处理MT2细胞之后,与对照组相比,p62蛋白水平下降,LC3-Ⅰ表达下降,LC3-Ⅱ表达升高,病毒蛋白Tax、p19表达水平升高；使用HMGB1释放抑制剂GA和中和抗体处理细胞之后,p62蛋白水平升高,LC3-Ⅰ表达升高,LC3-Ⅱ表达下降,病毒蛋白Tax、p19表达水平下降。4、共聚焦显微镜结果：rhHMGB1处理细胞之后,可见胞质中LC3荧光颗粒明显增多,并聚集成团块状。使用HMGB1释放抑制剂GA和特异性中和抗体处理细胞之后,LC3呈点状荧光颗粒散布于HeLa细胞质内。结论HMGB1通过促进HTLV-1病毒感染细胞自噬,促进细胞内HTLV-1病毒的复制。