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细胞命运由细胞微环境决定,多种细胞命运相互协调决定组织器官的生命活动,体外添加阶段性的细胞外基质蛋白,模拟细胞在体内的生长环境,有望促进细胞的增殖作用以及功能维持。Lumican作为富含亮氨酸小分子蛋白聚糖家族的一员,是细胞外基质重要的构成部分,可以调控细胞生命活动。本文分析Lumican蛋白在肝脏发育不同阶段的表达水平,发现胎肝中Lumican表达水平更高,显示出作为细胞外环境重要组成成分,Lumican蛋白在肝祖细胞的细胞增殖与功能维持过程中具有更为重要的作用。在第一部分中,通过分离获得胚胎12-14天胎肝细胞,利用KM培养基进行初步2D肝干/祖细胞的筛选培养,并利用透明质酸及KM培养基配制水凝胶建立3D细胞培养体系。我们成功建立基于透明质酸的小鼠胎肝细胞的3D无血清培养体系,并可促进小鼠胎肝细胞肝细胞功能进一步成熟。在第二、三部分中,通过对胎鼠与成年鼠肝脏组织行Q-PCR,发现Lumican在幼年肝脏组织中的表达高于成年肝组织中。再对其行免疫荧光染色,发现Lumican在肝脏内各亚型细胞广谱表达,包括肝实质细胞、内皮细胞和星状细胞,主要为实质细胞表达,并分泌到细胞间隙。PCNA是细胞增殖标志,在增殖旺盛的细胞中表达,胎肝组织表达高于成年肝组织。同时,与成年肝组织相比,胎肝组织表达更高水平的Lumican,Lumican~+细胞PCNA~+比例更高,显示Lumican~+的肝细胞具有更强的增殖活性。我们还分别探讨了重组Lumican蛋白对原代肝祖细胞以及肝祖细胞系HepaRG细胞的促增值作用及对其功能的影响。对从孕12-14日小鼠胚胎中分离的胎肝细胞用KM培养基进行筛选培养,获得具有大量纯化呈克隆状生长的肝祖细胞,并用Lumican进行处理,发现Lumican处理组CK19~+Ki67~±阳性率(31.50%±1.00%)高于对照组(15.78%±0.99%),具有统计学意义(P<0.05)。通过Q-PCR发现,在Lumican浓度的增加的同时,干性基因如AFP、CK19、EpCAM等相关表达增强,功能基因如ALB、CPS1、CYP3A41a等表达减弱,与细胞免疫荧光结果相符。结果显示Lumican可促进胎肝细胞的增殖,同时增强肝细胞干性基因的表达。以Lumican重组蛋白2D培养HepaRG细胞,用Ed U染色法测定各组S期的比例,发现随着蛋白浓度的增加,增殖期细胞数亦同步增长,具有浓度依赖效应,各组之间增殖期细胞比例具有统计学意义(P<0.05),与CCK8法测定所得单日细胞增殖速率结果相符。经Q-PCR检测肝祖细胞增殖相关基因如p53、p21、p27、CDC20、CDC25A、CDC25B等及干性基因如AFP、CK19、EpCAM等表达增强,具有浓度依赖效应,而功能基因如ALB、CPS1、CYP3A4等则与之相反,随浓度增加表达减弱,与细胞免疫荧光结果相符。将Lumican加入HepaRG 3D培养体系,发现Lumican处理组增殖基因及干性基因表达增强,而功能基因表达减弱,同时对CYP3A4酶活性及ALB合成检测,发现HepaRG 3D培养体系中Lumican处理组对两者的检测结果低于对照组,具有统计学意义。故Lumican可延缓HepaRG的肝向成熟,维持细胞干性,促进细胞增殖。整合素信号途径是Lumican作用得以实现至关重要的一环。通过Co-IP,发现整合素α2(Integrinα2,ITGα2)与Lumican之间具有相互作用,ITGα2是Lumican结合的配基。对细胞增殖信号通路关键蛋白的抑制,筛选出Lumican促进HepaRG细胞增殖的作用通路——ERK和mTOR信号通路。以蛋白免疫印迹法验证ERK和mTOR信号途径下游关键蛋白的存在,结果显示ERK通路下游的P21、CCND1以及mTOR信号途径下游蛋白如P70 S6 kinaseα等的表达随Lumican浓度的增高而上升,pERK是ERK信号通路的标志,在Lumican处理的第60分钟出现瞬时表达。Lumican可通过与ITGα2的相互作用,激活ERK信号途径以及mTOR信号途径促进细胞的增殖作用。我们进一步探讨了Lumican的缺失对HepaRG细胞以及在体内对肝细胞再生的影响。siRNA沉默HepaRG细胞系Lumican基因后,细胞增殖水平降低,Lumican表达水平降低。通过水动力法经尾静脉注入siRNA,降低Lumican在BALB/C小鼠肝脏的表达水平。24小时后,行肝大切手术,收取肝切后24小时及48小时肝脏,发现正常小鼠肝内PCNA及Lumican都处于低表达状态,而在肝大切后24小时及48小时,PCNA及Lumican在肝脏组织中广泛表达。而经siRNA沉默的BALB/C小鼠,肝切前其肝组织内PCNA及Lumican的表达特性与正常BALB/C小鼠无异,但在肝切后24小时及48小时,siRNA处理的BALB/C小鼠PCNA及Lumican在肝组织中的表达远不如正常小鼠肝切后。Lumican基因表达的可延缓肝细胞的再生。综上所述,我们通过Lumican通过与ITGα2的相互作用,激活ERK和mTOR信号通路促进细胞增殖,维持细胞干性,延缓细胞成熟,它的缺失可延缓或抑制肝组织的再生。