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目的:构建梅毒螺旋体(Tp)三价粘附素(Tp0751-Tp0136~N-Tp0435)原核及真核重组菌影(BG),期望能在BALB/c小鼠体内有效诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答,为发展新型梅毒疫苗奠定基础。方法:构建pET30a-E’-Tp0751-Tpr0136~N-Tp0435原核表达重组体(E’为菌影锚定蛋白/基因),转化入大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达融合蛋白,通过化学渗透压法制备原核重组蛋白菌影(E’-Q-BG,Q=Tp0751-Tpr0136~N-Tp0435蛋白),检测菌影裂解率,琼脂糖电泳法鉴定菌影,WB鉴定目的蛋白表达。构建pcDNA3.1(+)-Tp0751-Tp0136~N-Tp0435真核表达重组体,将其转载入预先用化学渗透压法制备的空菌影JM109中,制备成重组真核菌影(pcD-Q/BG,Q=Tp0751-Tpr0136~N-Tp0435编码基因)。将菌影中真核重组质粒转染至鼠源性巨噬细胞RAW264.7中,48 h后用WB鉴定目的蛋白表达。将49只雌性BALB/c小鼠随机分成7组,每组7只。三个对照组分别为:A(PBS组)、B(空菌影组,BG)和C(空质粒组,pcD);四个实验组分别为:D(裸真核重组质粒组,pcD-Q)、E(真核重组菌影组,pcD-Q/BG)、F(原核重组菌影组,E’-Q-BG)和G(异源加免组,pcD-Q/BG+E’-Q-BG,即E组初免2次,F组加免1次)。肌注免疫,共3次,每次间隔2w。于初次免疫后第2w、4w、6w(6w即末次免疫后2w)分别收集小鼠尾静脉血/眼部血和阴道灌洗液,用ELISA法检测特异性血清抗体IgG、IgG2a、IgG1、生殖道灌洗液SIgA水平以及末次免疫后各抗体效价;末次免疫后2w眼部采血并处死小鼠制备小鼠脾细胞,CCK-8法检测免疫小鼠脾细胞增殖情况及ELISA检测IFN-γ分泌水平。结果:构建的三价原核重组表达载体在菌影内有效表达目的蛋白,WB显示该蛋白能与Tp感染兔血清特异性反应;原核重组菌影裂解率可达98%以上,琼脂糖电泳显示胞内无核酸;构建的三价真核重组表达载体在空菌影的转载率为74.7%,WB显示菌影中真核重组质粒转染至RAW264.7细胞后表达的蛋白能与Tp感染兔血清特异性反应。各实验组的特异性血清IgG、IgG2a、IgG1及生殖道粘膜SIgA均随免疫时间延长而逐渐上升,各时间点均高于对照组(P<0.01),并于初免后第6 w到达峰值,此时G组各抗体效价分别为1:51,200、1:51,200、1:6400和1:1600。对IgG、IgG1、IgG2a,E、F和G组均高于D组(P<0.01),G高于E与F组(P<0.05),E与F组间无明显差异;对SIgA,E、F、G组间无明显差异,但都高于D组(P<0.01);实验组IgG2a/IgG1均小于1。末次免疫后2w,实验组SI和IFN-γ水平均高于对照组(P<0.01),E、F和G组均高于D组(P<0.01),G高于E与F组(P<0.05),E与F组间无明显差异。结论:1.成功构建能有效表达三价粘附素Tp0751-Tp0136~N-Tp0435的原核重组菌影和真核重组菌影。2.三价粘附素原核菌影和真核菌影均能有效诱导小鼠产生Th1/Th2混合、Th2偏向的系统免疫应答和局部粘膜应答,异源加免比同源加免方式更有效。