论文部分内容阅读
研究背景与目的:脑梗死是指脑组织局部血液供应障碍,导致缺血缺氧,造成缺血区脑组织的损伤坏死。脑梗死是最常见的脑血管疾病类型,具有高发病率、高复发率、高死亡率及高致残率的特点。目前主要以抗凝、抗血小板药物预防和急性期的溶栓、取栓治疗方法为主,但仍缺乏有效的神经保护治疗手段。由于溶栓及取栓治疗时间窗较短,因此不到10%的患者可获益于该治疗方法,给个人、家庭和社会带来沉重的负担。因此促进脑梗死病人神经功能恢复成为当前脑梗死治疗的关键问题。既往关于脑梗死治疗聚焦于神经保护、干细胞移植、神经再生等,但大多数治疗策略均未取得明显的进展。分析其原因,梗死区域的干细胞或者新生神经元得不到充足的能量和氧气供应而无法存活,提示我们无论是促进神经元自我修复还是干细胞移植治疗,其先决条件都是需要有良好的血循环为神经元的再生及修复提供氧气和能量。“促血管生成疗法”正是基于此目的,以达到促进脑梗死病人神经功能恢复的目标。已有证据表明,脑梗死后的新生血管在促进神经功能恢复中发挥了重要作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）可以促进脑梗死后血管生成,但其在临床试验中却未取得明显的疗效。因为VEGF的确诱导产生了大量的新生血管,但这些新生血管数量虽多却形态异常,呈现“烟雾状”,大量新生血管呈现高通透性和缺乏周细胞覆盖,也就是说多数的新生血管呈现无功能状态。因此,深入研究脑梗死后血管生成的精确机制,促进有功能新生血管形成,才能为脑梗死的治疗提供新靶点。周细胞是脑微血管的重要组成成分,嵌入在与血管内皮直接接触的基膜内,覆盖于毛细血管壁。研究表明,在小鼠中枢神经系统的发育中,周细胞缺失会导致严重脑血管畸形。此外,周细胞还可以调控内皮细胞紧密连接蛋白表达和囊泡转运、调控脑血流,提示周细胞在脑微血管发育及成熟过程中发挥着不可或缺的作用。现有研究认识到,在脑微血管发育过程中,内皮细胞出芽成管,分泌细胞因子作用于周细胞,促进对周细胞的招募,是血管生成不可缺少的环节。但周细胞究竟在脑梗死后血管生成中与内皮细胞存在怎样的相互作用,其功能受哪些信号通路调控?尽管取得了一定进展,但尚未完全研究清楚。VEGF是调控脑梗死后血管生成的重要因子,其在脑微血管上的受体主要为血管内皮生长因子受体1（Vascular endothelial growth factor receptor1,VEGFR1）和血管内皮生长因子受体2（Vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2）。脑梗死后,缺氧诱导脑组织VEGF表达量增加,并激活内皮细胞VEGF/VEGFR2信号通路,促进内皮细胞增殖和迁移。研究发现,在血管生成过程中,内皮细胞VEGFR1竞争性结合VEGF抑制内皮细胞VEGF/VEGFR2信号通路,进而抑制内皮细胞增殖和迁移。此外,敲除小鼠VEGFR1后,内皮细胞过度增生,新生血管出芽受到抑制,新生血管分支也显著减少,但周细胞VEGFR1对血管生成的作用仍不清楚。由于转录后可变剪切的作用,VEGFR1基因编码膜受体和可溶性受体,既往研究认为,细胞膜VEGFR1发挥着胞内信号转导的作用,而可溶性VEGFR1可作为一个分泌因子,在细胞间交流的起着重要作用。为此,本研究利用诱导性敲除周细胞VEGFR1小鼠构建脑梗死模型,并结合体外血管生成模型,探讨周细胞VEGFR1对脑梗死后血管生成的调控作用及机制。方法:第一部分周细胞VEGFR1对脑梗死后血管生成的作用检测脑梗死后周细胞VEGFR1表达变化特点构建脑梗死模型,分别于梗死后0、1、3、5、7、14天后处死小鼠,取出梗死区域组织提取RNA。采用qPCR方法检测梗死组织中细胞膜VEGFR1 mRNA和可溶性VEGFR1 mRNA的表达变化。在小鼠梗死后7天处死小鼠,取出梗死区域并利用流式细胞术分选出PDGFRβ+细胞和CD31+细胞,采用qPCR和ELISA方法检测两种细胞中细胞膜VEGFR1和可溶性VEGFR1表达量。采用免疫荧光方法,检测脑梗死后7天VEGFR1表达量的变化。探寻周细胞VEGFR1对脑梗死后血管生成的影响利用诱导性敲除VEGFR1(Vegfr1iΔPC)小鼠构建脑梗死模型,计算脑梗死后7、14天脑梗死体积大小;采用免疫荧光标记CD31,检测Vegfr1iΔPC小鼠脑梗死7天后新生血管数量和长度,并利用生物素化的植物凝集素灌注,检测新生血管的功能;利用荧光示踪分子灌注结合免疫荧光标记NG2,检测Vegfr1iΔPC小鼠脑梗死后新生血管的通透性和周细胞的覆盖率。第二部分周细胞VEGFR1调控脑梗死后血管生成的机制1.研究周细胞VEGFR1对内皮细胞出芽的调控作用在脑梗死后7天利用流式细胞术分选出梗死周边区域PDGFRβ+细胞和CD31+细胞,利用Western blot检测两种细胞内VEGFR2和Akt磷酸化水平。利用VEGFR1 shRNA干扰人脑原代微血管周细胞（human brain primary microvascular pericytes,HBPCs）VEGFR1表达后,与人脑原代微血管内皮细胞（human brain primary microvascular endothelial cells,HBECs）在基质胶中共培养,体外模拟内皮细胞出芽实验,观察HBPCs VEGFR1调控HBECs的出芽的作用,并采用Western blot检测HBECs中VEGFR2和Akt磷酸化水平。2.研究周细胞VEGFR1对周细胞自身迁移和招募的调控作用利用VEGFR1 shRNA干扰HBPCs VEGFR1表达后,采用划痕实验和Tranwell小室迁移实验,评估周细胞VEGFR1对周细胞迁移功能和内皮细胞招募周细胞作用的影响。使用PIGF刺激HBPCs后,利用免疫荧光标记胞内VEGFR1,并利用Western blot检测HBPCs内Akt磷酸化水平。结果:第一部分正常野生小鼠脑梗死后0、1、3、5、7、14天,脑组织细胞膜VEGFR1mRNA和可溶性VEGFR1 mRNA表达量明显升高,在脑梗死后3、5天达到最高,随后开始下降;脑梗死后7天,脑组织梗死区域周细胞中细胞膜VEGFR1和可溶性VEGFR1表达量明显升高,但在内皮细胞中变化不明显。特异性敲除周细胞VEGFR1后,小鼠脑梗死后新生血管数量显著减少,新生血管通透性显著增大,周细胞覆盖率也明显减少,且周细胞形态异常并与内皮细胞结合不紧密。第二部分周细胞通过旁分泌可溶性VEGFR1的作用抑制内皮细胞中VEGFR2的激活,进而调控内皮细胞出芽。干扰周细胞VEGFR1的表达后,周细胞迁移能力明显减弱,内皮细胞对周细胞的招募作用也明显减弱。此外,周细胞内Akt磷酸化明显被抑制。结论:上述研究提示,周细胞VEGFR1在脑梗死后具有促进血管生成,促进新生血管结构和功能成熟的作用。在脑梗死后血管生成过程中,周细胞通过旁分泌可溶性VEGFR1,作用于内皮细胞,调控内皮细胞出芽;同时,周细胞VEGFR1通过促进自身胞内Akt磷酸化,促进内皮细胞对周细胞的招募。该研究不仅阐明了周细胞调控脑梗死后血管生成的新机制,也为“促血管生成疗法”提供了新思路、新靶点,具有重要的理论和现实意义。