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目的:探讨GFRα2、HER2不同表达状况对乳腺癌细胞的他莫昔芬(TAM)敏感性等生物学行为的影响,以及GFRα2和HER2表达状况的相关性,初步阐明GFRα2和HER2在乳腺癌的内分泌治疗耐药等过程中的作用,为将新的生物学标志物应用于乳腺癌个体化诊治提供理论依据。方法:一、GFRα2和HER2表达状况的相关性分析1、分别采用荧光定量PCR和Western blot检测亲本乳腺癌细胞株MCF-7和前期研究中成功建立并稳传的他莫昔芬(TAM)耐药细胞株D14中GFRα2和HER2的表达水平。2、分别将含有GFRα2和HER2基因片段的慢病毒载体转染MCF-7细胞株,建立GFRα2过表达细胞株MCF-7/G和HER2过表达细胞株MCF-7/H;并设置含空载体病毒的阴性对照MCF-7/NC。采用荧光定量PCR和Western blot检测相应细胞株中GFRα2和HER2的表达水平。3、使用iRNA干扰技术,分别构建沉默GFRα2和HER2的慢病毒载体,敲低GFRα2过表达细胞株MCF-7/G中GFRα2的表达,建立GFRα2低表达细胞株MCF-7/Gs;敲低HER2过表达细胞株MCF-7/H中HER2的表达,建立HER2低表达细胞株MCF-7/Hs;并设立阴性对照细胞株MCF-7/NC。采用荧光定量PCR和Western blot分别检测GFRα2低表达细胞株和HER2低表达细胞株中GFRα2和HER2的表达水平。4、使用iRNA干扰技术,分别敲低他莫昔芬耐药细胞株D14中GFRα2和HER2的表达,获得低表达GFRα2的耐药细胞株D14/Gs和低表达HER2的耐药细胞株D14/Hs;并设立阴性对照细胞株D14/NC。采用荧光定量PCR和Western blot检测相应细胞株中GFRα2和HER2的表达水平。通过上述实验,明确GFRα2和HER2表达状况的相关性。二、GFRα2、HER2不同表达状况对乳腺癌细胞生物学特性的影响利用CCK8实验、平板克隆、Transwell小室实验以及流式细胞术等技术和方法,分析GFRα2、HER2不同表达状况对乳腺癌细胞对TAM的敏感性,以及增殖和克隆形成能力、迁移和侵袭能力、细胞周期和凋亡等生物学特性的影响。结果:一、GFRα2和HER2表达状况的相关性分析1、GFRα2、HER2在D14细胞中的表达水平显著高于MCF-7,提示GFRα2、HER2的表达水平与莫昔芬耐药相关。2、与阴性对照组相比,GFRα2过表达细胞株MCF-7/G中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05);同样的,HER2过表达细胞株MCF-7/H中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平也显著升高(均P<0.05)。3、与阴性对照组相比,在沉默GFRα2表达的MCF-7/Gs细胞株中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05);同样的,MCF-7/Hs细胞株中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平也显著降低(均P<0.05)。4、与阴性对照组相比,低表达GFRα2的耐药细胞株D14/Gs中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05);同样的,低表达HER2的耐药细胞株D14/Hs中,GFRα2和HER2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05)。上述实验结果表明,GFRα2和HER2的表达状况存在显著相关性。二、GFRα2、HER2表达水平对乳腺癌细胞生物学特性的影响(1)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞增殖能力的影响:分别过表达GFRα2和HER2,均可显著促进癌细胞的增殖能力;分别沉默GFRα2和HER2过表达细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的增殖能力;耐药细胞的增殖能力显著高于MCF-7细胞;分别沉默耐药细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的增殖能力(P<0.05)。(2)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞克隆形成能力的影响:分别过表达GFRα2和HER2,均可显著促进癌细胞的克隆形成能力;分别沉默GFRα2和HER2过表达细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的克隆形成能力。耐药细胞的克隆形成能力显著高于MCF-7细胞;分别沉默耐药细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的克隆形成能力(P<0.05)。(3)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞侵袭能力的影响:分别过表达GFRα2和HER2,均可显著促进癌细胞的侵袭能力;分别沉默GFRα2和HER2过表达细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的侵袭能力;耐药细胞的侵袭能力显著高于MCF-7细胞;分别沉默耐药细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的侵袭能力(P<0.05)。(4)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞迁移能力的影响:分别过表达GFRα2和HER2,均可显著促进癌细胞的迁移能力;分别沉默GFRα2和HER2过表达细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的迁移能力;耐药细胞的侵袭能力显著高于MCF-7细胞;分别沉默耐药细胞中的GFRα2和HER2,均可显著抑制癌细胞的迁移能力(P<0.05)。(5)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞的TAM敏感性的影响:GFRα2过表达可显著降低MCF-7细胞对TAM的敏感性;沉默GFRα2过表达细胞中的GFRα2的表达可逆转癌细胞对TAM的敏感性(P<0.05)。(6)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞周期的影响:GFRα2、HER2过表达均可促进乳腺癌细胞的细胞周期进程(由G0/G1期进入S期/M期);分别沉默GFRα2、HER2,均可显著抑制癌细胞的细胞周期进程;与MCF-7比较,耐药细胞株的细胞周期进程显著增强;分别沉默GFRα2、HER2,均可显著抑制耐药细胞的细胞周期进程(P<0.05)。(7)GFRα2和HER2表达水平对乳腺癌细胞凋亡的影响:GFRα2过表达和HER2过表达,均显著抑制MCF-7细胞的凋亡;分别沉默过表达细胞株中的GFRα2、HER2,均可促进癌细胞凋亡;耐药细胞株的凋亡显著少于MCF-7细胞株;沉默耐药细胞株中的GFRα2,均可显著促进癌细胞的凋亡(P<0.05)。结论:1、在激素受体阳性乳腺癌细胞中GFRα2和HER2的表达水平存在正相关性。2、分别过表达GFRα2和HER2能显著增强MCF-7等乳腺癌细胞株的体外增殖、克隆形成、侵袭和迁移能力,并促进细胞周期进程和减少凋亡,另外过表达GFRα2可显著降低细胞对TAM的敏感性;分别沉默GFRα2和HER2可逆转MCF-7等乳腺癌细胞株的上述生物学行为,尤其是沉默GFRα2可显著提高细胞对TAM的敏感性。