高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV) H5N1的宿主范围极为广泛,可感染野生禽类,家禽,人或其它哺乳动物,严重威胁人类健康和社会稳定,造成巨大的经济损失。在1997年,H5N1病毒被首次证实可突破种属限制感染人类,并致人死亡。据世界卫生组织统计,自2003年至今,全球已经有15个国家,超过600人感染H5N1病毒,死亡率高达60%。但是,关于H5N1病毒如何跨越种属屏障及对人致病的分子机制尚不清楚。A型流感病毒的基因组是由8个单股负链RNA (ssRNA)组成,每一条单股负链RNA又可分为具有调控功能的位于两端的非编码区(UTR),以及位于中间的编码区(CDS)。所有A型流感病毒基因组的5’端和3’端UTR均具有13个和12个高度保守的核苷酸序列,但只有3’端UTR (3’UTR)第4位碱基存在多样性。5’端和3’端UTR序列部分互补,可以形成特定的二级结构,作为启动子差异化地调节病毒基因组的转录、复制,同时亦可影响病毒mRNA的腺苷酸化及子代病毒基因组的装配。但是,目前尚没有研究阐明流感病毒的UTR,尤其是3’UTR第4位碱基与病毒致病性之间的关系。本研究分析了A型流感病毒基因组中3’UTR第4位碱基的分布,并以H5N1亚型流感病毒A/Vietnam/1194/2004株为模式株,探讨PB1、HA和NA上该位点突变与病毒RNA聚合酶活性、基因组表达、病毒复制能力和病毒致病性之间的关系,从而揭示H5N1亚型流感病毒3’UTR第4位碱基的功能及其在病毒致病机制中发挥的作用。一A型流感病毒中3’UTRs第4位碱基(U4)和(C4)的分布首先,我们从NCBI (National Center for Biotechnology Information)的IVR(Influenza Virus Resource)中下载A型流感病毒的基因序列信息,去除测序不完整、测序明显错误、UTR信息缺失、含稀有碱基、重复上传、实验室构建株和疫苗株等序列后,共获得8332个有效序列信息。利用基于Perl语言编写的程序,分析这些序列对应3’端第4位碱基的分布。A型流感病毒的序列信息分析结果显示,在经过序列比对后证实,所有基因序列的5’端前13个碱基序列和3’端前12个碱基序列均高度保守,为5’-UCAUCUUUGUUCC和3’-UCG U/CUUUCGUCC,只有3’端第4位碱基或为尿嘧啶或为胞嘧啶,称为U4或C4。3’UTRs第4位碱基在所有A型流感病毒及其不同毒株来源间为U4的比例远远高于C4,在不同亚型间的分布也得到了同样的结果。而在不同的基因片段上则得到了差异化的结果：虽然8个基因片段上U4的比例都高于C4,大于50%,但是C4在聚合酶基因片段上的比例(约为40%),高于其在非聚合酶基因片段上的比例(15%以下)。H5N1亚型流感病毒的序列信息分析结果显示,该位点在所有H5N1病毒中为U4的比例远高于C4,与A型流感病毒整体的结果相一致。而其在不同基因片段上的分布则比A型流感病毒整体的结果有一定差异：在非聚合酶基因片段上,U4>50%> C4;在聚合酶基因片段上,C4>50%> U4。另外,当H5N1病毒的来源不同时,聚合酶基因和非聚合酶基因片段上的U4和C4的分布存在更大的差异：无论来源于人还是禽的H5N1病毒,PB1基因均偏好C4; PB2和PA基因在人来源的H5N1病毒中偏好U4,而在禽来源H5N1病毒中偏好C4。上述结果表明,UTRs第4位碱基为U4是A型流感病毒及亚型H5N1病毒在自然选择压力下优先的选择,可能具有重要的功能。该位点在基因片段间的差异化分布表明,H5N1病毒不同于A型流感病毒其它亚型,其进化趋势可能存在特定的方向：聚合酶基因偏好C4,非聚合酶基因偏好U4。另外,这种偏好与病毒的宿主来源存在相关性,提示该位点在病毒种属限制和宿主适应性上可能发挥作用。二UTRs第4位碱基(U4和C4)与病毒致病力之间关系为了确定UTRs第4位碱基与H5N1病毒致病力之间的关系,本研究首先构建了H5N1病毒反向遗传学系统,并拯救获得重组病毒,然后建立空斑测定方法,对重组病毒进行鉴定,最后利用小鼠感染模型对重组病毒的致病性进行测定。采用反向遗传学系统,以A/Vietnam/1194/2004(H5N1, VN1194)为模式株,拯救得到四株重组病毒——-rVN-(C)(基因组第4位碱基全为C4), rVN-PB1(U)(只有PB1上第4位碱基为U4,其它全为C4), rVN-HA(U)(只有HA上第4位碱基为U4,其它全为C4)和rVN-NA(U)(只有NA上第4位碱基为U4,其它全为C4)。然后通过滴鼻的方式,以10、100、1000和10000PFU的剂量感染Balb/C小鼠,观察小鼠的临床表现、生存时间和体重变化。结果显示,在感染剂量超过100PFU时,所有实验组小鼠均在10天内死亡,死亡率高达100%,说明这四种重组病毒对小鼠致病力很强。而在较低剂量(10PFU)感染时,rVN-(C);(?)rVN-PB1(U)感染小鼠存活率分别达到了80%和60%(图2-4),而rVN-HA(U)和rVN-NA(U)导致感染小鼠全部死亡(图2-4),这说明四种重组病毒对BalbC小鼠致死力如下：rVN-HA(U)和rVN-NA(U)最强,其次为rVN-PB1(U), rVN-(C)最弱。另外通过对感染小鼠存活时间进行统计,按照Reed-Muench法计算并分析LD50(LD50以病毒的PFU数表示),结果显示：rVN-(C)MLD50为23.7PFU；与rVN-(C)感染组相比,rVN-PB1(U)感染组小鼠死亡趋势类似,其MLD50为13.6PFU；而rVN-HA(U)和rVN-NA(U)感染组小鼠在较低剂量(10PFU)感染时,死亡率已高达100%,其MLD50均低于10PFU；上述试验证实,无论UTRs第4位碱基为U4或C4,重组病毒均对小鼠具有很强致死性,且含U4的病毒的毒力稍稍高于含C4的病毒。同时,感染剂量为100PFU和1000PFU时,小鼠的体重变化也存在一定的差异。较低剂量(100PFU)感染下,四组小鼠体重在感染2天内开始有缓慢地增长,而在第2天则开始显著地下降,并同时伴随有伴随有小鼠的死亡,试验检测终点为8天。统计学结果显示,与作为对照的rVN-(C)组相比,含有U4的rVN-PB1(U)、rVN-HA(U)和rVN-NA(U)病毒在不同的观测时间可导致小鼠体重显著下降(P<0.05、P<0.01和P<0.0001)。而在较高剂量(1000PFU)地感染下,四组小鼠体重没有增长期,体重降低时间提前,感染后6d小鼠全部。但是与作为对照的rVN-(C)组相比,rVN-PB1(U)病毒引起体重变化没有显著差异((P>0.05)),而rVN-HA(U)和rVN-NA(U)贝在感染后第3天和第4天导致小鼠体重下降较为显著((P<0.05)。实验证明,UTRs第4位碱基由C4突变为U4可显著增强病毒致病力。三UTRs第4位碱基对病毒增殖的影响为深入研究UTRs第4位碱基对病毒增殖的影响,我们选用了对流感病毒敏感的MDCK细胞,研究4株重组病毒在感染细胞中的增殖能力,通过测定增殖曲线,分析、确定UTRs第4位碱基与病毒增殖能力之间的关系。以0.01感染复数对MDCK细胞进行感染试验,检测重组病毒在330C、370C和39℃下的增殖能力,利用空斑形成试验测定感染后0h、6h、12h、24h及48h时,上清中病毒的滴度,结果以PFU/mL表示。重组病毒的增殖曲线表明,四种病毒的在不同温度下的复制周期并不完全-直,存在一定的差异。在较低温度(33℃)感染下,直到感染后48小时,四种病毒的滴度依然处于对数增长期。与对照组rVN-(C)相比,rVN-PBl(U)复制滴度显著升高(24和48小时),而rVN-HA(U)和rVN-NA(U)滴度具有显著差异的感染时间为24和12小时。而当温度为37℃时,感染后24小时四种病毒即到达复制的平台期。比较rVN-PB1(U)和rVN-(C)时发现,二者复制动力学特征一致,前者滴度显著高于后者。rVN-HA(U)和rVN-NA(U)的增殖曲线则与rVN一(C)存在一定的差异,感染后12小时,前二者的增殖速率显著高于后者。较高的温度(39℃)时,24小时时四种病毒增殖得到最高滴度,与37℃时相同,但是四种病毒的增殖曲线差异较大。与作为对照的rVN-(C)相比,rVN-PB1(U)、rVN-HA(U)、 rVN-NA(U)在感染早期(6-12小时)复制效率显著增强。实验证实,UTRs第4位碱基由C4突变为U4显著增强病毒的增殖能力,且这种增强作用在很宽的温度范围内均存在。四3’UTRs第4位碱基对聚合酶转录和复制活性的影响为深入研究UTRs第4位碱基的其它功能,我们利用荧光素酶报告系统对RNA聚合酶转录活性进行了检测,同时也对病毒复制中基因组表达水平进行分析。首先,利用分子生物学方法构建报告质粒(PB1-LUC(U4)、PB1-LUC(C4)、 HA-LUC(U4)、HA-LUC(C4)、NA-LUC(U4)和NA-LUC(C4)),并检测报告系统转染试验的聚合酶活性。结果显示,PB1、HA和NA上U4可显著增强聚合酶的转录活性：3种不同的温度下,与PB1-LUC(C4)组相比,PB1-LUC(U4)的聚合酶活性均显著增强,分别为对照组的40.60%±3.53%(33℃),36.91%±2.43%(37℃)和29.70±3.52%(39℃)；与HA-LUC(C4)组相比,HA-LUC(U4)的聚合酶活性均显著增强,分别为对照组的52.91±2.52%(330C),54.86±5.66%(370C)和41.21±1.73%(39℃)；与NA-LUC(C4)组相比,NA-LUC(U4)的聚合酶活性均显著增强,分别为对照组的40.60±3.53%(330C),36.91±2.43%(370C)和29.70±3.52%(39℃)。此外,建立流感病毒基因组表达检测技术,并对MDCK细胞在0.01MOI感染下33℃、37℃和390C时,三种RNA (vRNA、cRNA和mRNA)表达进行精确的区分和定量分析。结果显示,3种温度下,三种RNA分子的含量均随着感染时间的变化而变化。与对照组rVN-(C)相比,感染后在6-8h, rVN-PB1(U)组转录mRNA含量显著上升,与对照组rVN-(C)相比,而感染后8h, rVN-PB1(U)组复制得到的cRNA和vRNA却显著下降,并且这种增强或抑制作用不随温度的变化而变化。实验证明,UTRs第4位碱基由C4突变为U4显著增强RNA聚合酶转录活性,差异化调节基因组表达：上调mRNA转录和下调cRNA合成。同时,U4拓宽了流感病毒聚合酶的温度适应范围,在较低和较高的温度(33℃和39℃)下,依然具有调控功能。本研究从A型流感病毒中3’UTRs第4位碱基U4/C4多样性分析入手,得到了该位点的差异化分布信息,提示其在流感病毒进化中可能存在重要功能,以及这种功能与病毒种属限制和宿主适应性之间有一定关系。研究结果表明,UTRs第4位碱基突变(C4变为U4)可使病毒致病力增强,且这种增强作用与病毒RNA聚合酶活性增强、基因组表达差异化调节及病毒复制能力增强有关。本研究拓展了对流感病毒基因组功能的了解,为禽流感病毒致病分子机制研究提供了新的实验依据。同时,也可为流感病毒疫情的防控工作提供理论指导。