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利用植物修复土壤污染是一种新兴的环境生物技术,其研究的基础是超积累植物(hyperaccumulator)的发现和应用,但超积累植物大都具有生物量相对较小、根系不够发达等缺陷,不能投入到大型生产实践中。MIR156作为植物生长发育的重要调控因子,可以调控植物生长周期、生物量及根系发育等。本研究首先以拟南芥为试验材料,采用基因敲除和过表达技术,产生过表达MIR156拟南芥植株(35S::MIR1564)和MIM156敲除拟南芥植株(Ubi10::MIM156),并研究它们对Cd胁迫的耐受表型及耐受机制。然后,选择镉超累积植物伴矿景天,开展MIR156调控植物镉胁迫耐受机制研究成果的应用,即在伴矿景天愈伤组织上,进行MIR156的过表达和敲除,以探究MIR156-SPLs网络途径调控下植物相关镉耐受和富集差异,解析MIR156-SPLs信号途径改良伴矿景天的可行性。主要结论如下:(1)拟南芥植株真叶长出后转基因植株与野生型植株表型逐渐表现出不同,35S::MIR156A叶片发生速率明显快于WT,并且下表皮毛发生显著晚于WT,叶片较圆缺刻少,开花延迟。Ubi10::MIM156表现出快速成熟的表型,叶片数量低于35S::MIR156A和WT,叶片缺刻多。(2)为了研究MIR156在拟南芥响应镉胁迫的过程中的作用,首先观察镉胁迫处理拟南芥的表型和损伤等级,统计结果显示,相比WT,MIR156过表达的植株35S::MIR156A在遭受镉胁迫后损伤较轻,而MIR156敲除的植株Ubi10::MIM156易发生严重的镉胁迫损伤表型。(3)拟南芥地上、地下的Cd含量的测定结果表明,根部镉的吸收量:35S::MIR156A>Ubi10::MIM156>WT;而地上部分的镉含量与地下不同,Ubi10::MIM156>WT>35S::MIR156A。虽然Ubi10::MIM156地下的镉吸收量最低,35S::MIR156A植株最高,但是地上部分的镉含量却与地下部分相反,这表明Ubi10::MIM156镉转运效率明显高于WT和35S::MIR156A,本研究结果表明MIR156可参与调控植物镉吸收转运过程。(4)为了阐明Cd在拟南芥MIR156过表达植株35S::MIR156A和MIR156敲除的植株Ubi10::MIM156中的分布差异的分子机制,测定了 ABC转运子(ATP-binding cassette transporters)、HAM(heavy metal ATPases)和 ZIP(Zrt/Irt-like Protein)等多个Cd转运子基因的表达量。结果显示,负责将根部的Cd转运进入根部细胞的重金属转运子ZIP1-4和将根部细胞内的Cd运输进入液泡的ABCC1基因在35S::MIR156A中的表达量均明显高于WT,而在Ubi10::MIM156中明显低于WT。茎中负责将Cd运输到地上部分的HMA4基因的表达量为:Ubi10::MIM156>35S::MIR15+4>WT。基于此,结合三种材料地下地上部分镉积累结果,推测35S::MIR156A材料中,镉吸收进入根内细胞多,大量镉被运输固定在细胞液泡中,同时茎的向上运输能力降低,最终导致根部镉的超量积累。(5)MIR156在植物发育过程中发挥重要的作用。在正常生长条件和5μM硫酸镉胁迫下,均为35S::MIR156A生物量明显高于WT,Ubi10::MIM15 显著低于WT。35S::MIR1564植株的侧根数量明显高于WT和Ubi10::MIM156植株,而35S::MIR156A根系覆盖广。Ubi10::MIM156的主根根长明显长高于WT和35S::MIR156A,表明该Ubi10::MIM156更有利于修复深层土壤。(6)以伴矿景天叶片为外植体,使用添加了 300mg/L的水解酪蛋白的MS培养基为基本培养基,建立了再生体系,为伴矿景天遗传转化提供受体材料。结果表明:愈伤组织诱导最佳培养基为:2,4-D 1mg/L+6-BA0.3mg/L,诱导率为92.01%;最优分化培养基为:2,4-D0.1mg/L+6-BA1mg/L,分化率为27.44%;适宜的芽增殖培养基为:2,4-D O.1mg/L+6-BA 0.5mg/L;适宜的生根培养基为:IBA1-2mg/L。伴矿景天的抗生素敏感性实验表明:适合伴矿景天愈伤组织遗传转化的抗生素类型为G418(庆大霉素衍生物),临界浓度为40mg/L,筛选时间为20天。(7)以包含NPTII(氨基糖苷类-3-磷酸转移酶)抗性标记基因的植物表达载体PBI21为骨架,构建了 MIR156A超表达载体(MIR156PBI)和靶基因模拟Mimicry156 表达载体(MIMPBI)。将 PBI121 空载、MIR156PBI、MIMPBI 载体借助基因枪轰击伴矿景天愈伤组织,经过G418多代筛选获得抗性愈伤组织。结果表明:转入MIR156PBI载体的愈伤组织鲜重增长最快、空载体次之、转入MIMPBI载体的愈伤组织增长最慢。(8)用1000μMCdS04和0μMCdSO4处理条件下愈伤组织的鲜重增长率的比值衡量Cd胁迫对伴矿景天愈伤组织的影响,转PBI121、MIR156PBI、MIMPBI载体的比值为0.49、0.66、0.31。1000μM CdSO4处理条件下转入MIR156PBI载体的愈伤组织质量优于转入MIM156的愈伤组织。这表明转入MIR156的伴矿景天愈伤组织对Cd的胁迫更耐受,在细胞水平上,MIR156可以增强伴矿景天对Cd的耐受性。