海带长、宽性状相关QTL定位及Tic20的功能验证

来源 :中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) | 被引量 : 0次 | 上传用户:huhuhuhuanguo
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海带(Saccharina japonica)分布于东亚沿海,是重要的海洋经济褐藻。本研究通过构建高密度遗传连锁图谱,进行了海带长、宽性状QTL定位;对筛选到的候选基因Tic20进行了基因克隆、亚细胞定位、跨膜拓扑结构分析以及蛋白相互作用的研究。相关结果对分析海带长宽性状形成的分子机制,及Tic20在海带中的结构与功能具有重要参考意义。在SLAF-seq的基础上,选取7627个SNP标记构建了具有31个连锁群,平均遗传距离0.69 cM的遗传连锁图谱;并对海带长、宽性状相关的QTL进行了定位与分析。共检测到12个QTL与叶片长度相关,10个QTL与叶片宽度相关。对海带长、宽增加均有增强效应的相关等位基因均来自亲本。将与长、宽性状均相关QTL的序列比较定位到海带基因组(MEHQ00000000)后,鉴定出14个叶绿体内膜易位子Tic20(Translocons at the inner envelope membranes of chloroplasts20)基因和3个肽酶s8和s53(Peptidase S8 and S53)基因。荧光定量PCR检测4个Tic20基因的表达水平不仅在两个亲本孢子体中存在差异,而且在同一亲本的不同培养时间也存在差异。此外,与海带长、宽密切相关的SNP标记可用于海带选种,并提高选择效率。Tic20是一种重要的易位子蛋白,在叶绿体蛋白转运过程中起着重要作用。本研究克隆了海带的Tic20-14基因,SjTic20-14蛋白结构分析发现其由N端非蓝藻起源的EF-hand功能域和C端蓝藻起源的Tic20功能域结合而形成非典型结构。以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为转基因验证模型,证实SjTic20-14定位于三角褐指藻叶绿体最内层膜,蛋白末端Nin-Cin朝向,跨膜拓扑结构为“M”型,EF-hand结构域完全伸入叶绿体基质中。此外,SjTic20-14的转入对三角褐指藻的生长有促进作用。但SjTic20-14在海带中的真实定位和拓扑结构,及其在海带中的功能尚需进一步验证。以光照处理的海带样品提取RNA,构建了高质量海带膜蛋白酵母双杂交文库。测定文库的库容量为1.44×107 cfu/m L,完整性和覆盖度良好;随机扩增重组率为100%,插入片段0.4~2.6 Kb,插入片段丰富度较高。以SjTic20-14为诱饵进行膜蛋白酵母双杂交筛选互作蛋白,筛库转化总克隆数5.84×106 cfu。在挑取的272个互作酵母菌落中获得99个cDNA序列,其中74个功能已知,25个功能未知。功能互作分析发现SjTic20-14广泛参与各种代谢(磷化合物、氮化合物、碳水化合物和DNA代谢等)、细胞组成(生物膜和动力蛋白)、转录调控、蛋白运输和光合作用等生命过程。对24对互作进行的回转验证均显示相互作用(阳性率100%);蛋白结合强度定量检测显示其中17个cDNA序列在分别与Tic20-14全长、EF-hand功能域和Tic20功能域互作时,蛋白结合强度在3者间有显著差异,提示SjTic20-14的结构完整性对其功能有一定影响。用BiFC实验在硅藻中验证到Tic20-14全长、EF-hand功能域和Tic20功能域与捕光复合体亚型6(Light harvesting complex 6,LHC6)均存在互作;间接反映出SjTic20-14可能通过与LHC6互作影响海带光合作用,而影响其长、宽性状的形成,进而影响海带生长。
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