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研究目的和背景2型糖尿病作为全球范围内发病率日益升高的疾病,给人们的健康和生活带来了极大的危害。胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发病的一个重要环节。葡萄糖是调节胰岛素分泌最重要的物质,在高糖条件下,胰岛β细胞的胰岛素分泌水平升高,使机体血糖水平恢复至正常。深入探讨高糖调节胰岛β细胞功能的具体机制,对2型糖尿病的防治具有重要意义。本研究利用基因芯片技术探讨高糖调节胰岛β细胞功能的具体分子机制。已有研究显示胰岛可通过自分泌/旁分泌神经激素调节自身功能,可卡因-苯丙胺转录调节肽(CART)是一种厌食性神经多肽,在多种啮齿动物2型糖尿病模型的β细胞中表达升高。此外,外源性CART可刺激β细胞的胰岛素分泌。我们的基因芯片结果显示,高糖可显著升高CART的表达。我们通过实验进一步研究高糖调节CART基因表达的机制及其在高糖促进胰岛素分泌中的可能作用。材料与方法1.使用胶原酶灌注法分离SD大鼠胰岛。2.预培养4小时后,分离的胰岛分别在对照(3.3mmol/L葡萄糖)和高糖(16.7mmol/L)条件下培养24小时。收集胰岛,抽提RNA,实验重复3次。3.三次2组样本RNA用Agilent Feature Extraction software(version 11.0.1.1)进行基因芯片分析。将样本RNA逆转录为cDNA,经标记后与4×44k芯片杂交。使用Agilent Scanner G2505C扫描仪扫描芯片的荧光强度,再将结果转换为数字型数据,并使用分析软件进行分析运算。将基因表达差异性的阈值设置为倍数改变≥2.0,P值<0.05有统计学意义。4.对基因芯片结果进行生物信息学分析。5.以不同浓度的葡萄糖处理分离SD大鼠胰岛,使用实时荧光定量PCR技术测定胰岛CART的mRNA表达水平。6.使用不同信号通路的激动剂和抑制剂处理大鼠胰岛,检测CART mRNA表达水平的变化。7.在大鼠胰岛转染CART过表达腺病毒,并以不同浓度的葡萄糖和药物进行处理,ELISA法检测胰岛素分泌水平。结果1.与对照组相比,高糖处理组有894个基因上调,888个基因下调。基因来源于权威数据库:Ref Seq、Ensembl、UCSC Goldenpath、Unigene和Gen Bank。2.对差异表达的基因进行基因本体(Gene ontology,GO)分析,包括生物学过程(Biological process)、细胞组成(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。并对差异表达的基因进行信号通路(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome,KEGG)分析。GO分析和KEGG分析的结果为我们初步了解差异表达基因的功能以及可能参与的信号通路提供了重要线索。3.基因芯片结果显示高糖上调大鼠胰岛CART的基因表达水平,实时定量PCR结果进一步验证了芯片结果。以16.7mmol/L葡萄糖处理大鼠胰岛不同时间,或以不同浓度葡萄糖处理胰岛24h,实时定量PCR结果显示葡萄糖可剂量和时间依赖性地上调胰岛CART的表达水平。4.葡萄糖激酶激动剂GKA50可显著上调胰岛CART的表达水平,而非代谢性葡萄糖类似物对CART的表达水平没有影响。5.蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89可下调高糖诱导的CART表达,并可逆转forskolin对CART表达的上调作用。与此同时,forskolin上调CART表达的作用可被失活型CREB抑制,且长效GLP-1类似物exendin-4能明显升高CART的表达水平。6.转染CART过表达病毒可以增强胰岛在不同葡萄糖浓度及forskolin处理条件下的胰岛素分泌。7.转染CART过表达病毒可以缓解地塞米松对大鼠胰岛功能的损害。结论1.基因芯片结果可靠,葡萄糖能广泛影响胰岛基因的表达谱。2.基因芯片结果显示,葡萄糖可以通过调节多种信号通路和生物学过程影响胰岛功能。3.高浓度葡萄糖通过激活cAMP信号通路上调CART基因表达。4.CART过表达可增强胰岛素分泌,并改善地塞米松对胰岛功能的损伤作用。