背景与目的牙周炎是发生在牙周支持组织的以牙菌斑为始动因子的慢性细菌感染性疾病,严重影响着患者的口腔健康。牙周致病菌不仅通过细菌本身及其产生的毒性代谢产物对牙周组织造成直接破坏,还通过细菌引发的长期持续炎症反应和免疫反应对机体造成更加严重的损害。牙周炎患者的牙周袋、龈沟液甚至外周血中均可检测到肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、IL-6等炎症因子的高表达,这些炎症因子水平的升高往往与一些慢性系统性疾病关系密切。因此,有学者又将牙周炎称为机体的“慢性炎症状态”。炎症、外伤、发育畸形和肿瘤等原因均可导致牙槽骨吸收和颌骨缺损,严重影响着患者的美观、咀嚼、发音,是口腔科常见临床问题之一。因此,调控骨重塑、恢复组织功能、促进颌骨愈合仍是目前口腔临床和基础研究的重点。骨缺损愈合经历血肿炎症机化、初始骨痂形成、骨或软骨形成和骨形成后改建四期;正常的生理性炎症在骨缺损愈合过程中发挥着积极作用。作为机体的重要防御反应,大部分生理性炎症反应对机体是有益的;然而,由于细菌入侵或其他因素导致的慢性炎症反应对机体是有害的,炎症反应过程中骨缺损愈合也必然会受到不同程度的干扰。研究发现,类风湿性关节炎、雌激素缺乏、肥胖或老化等患者的血液中炎症因子TNF-α的表达水平均有所升高,多种炎性因子通过不同途径刺激破骨细胞的分化、形成,从而抑制骨形成。牙周炎发生发展病理变化过程中炎症因子水平不断变化,炎症持续时间和作用强度差别较大,TNF-α等炎症介质的水平不断起伏变化,由此引发全身炎症状态的不稳定。那么,作为机体“慢性炎症状态”的牙周炎是否会对下颌骨骨缺损愈合产生一定程度的影响,以往的研究尚未见报道。因此,本实验选择在大鼠上颌磨牙建立牙周炎模型,在下颌骨体部建立颌骨缺损模型,评价牙周炎对下颌骨骨缺损愈合的影响,并应用重组人肿瘤坏死因子受体融合蛋白(recombinant human tumor necrosisifactor-Fc fusion protein,rhTNFR:Fc)全身注射的方法干扰TNF-α对成骨细胞和破骨细胞的作用,从而评价TNF-α在牙周炎环境下对下颌骨骨缺损愈合的影响。此外,还通过牙周洁刮治+局部冲洗的方法治疗实验大鼠牙周炎,模拟临床牙周治疗效果,观察非手术牙周治疗对大鼠下颌骨骨缺损愈合的影响,以进一步评价牙周炎对下颌骨骨缺损愈合的干扰情况。为临床下颌骨骨缺损患者必要的牙周治疗提供理论依据,以期为牙周炎微环境下骨缺损的治疗和功能改建提供新思路。材料和方法1.大鼠实验性牙周炎模型的建立采用正畸结扎丝结扎大鼠双侧上颌第一磨牙加局部内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)注射的方法,构建大鼠实验性牙周炎模型,分别于建模1周、2周、3周、4周后处死实验动物,取上颌骨标本进行HE染色;分离局部牙槽骨,剔除软组织后体视显微镜下进行骨吸收程度分析;采集实验动物外周血,分离血清,ELISA法检测血清TNF-α水平。2.牙周炎对实验大鼠下颌骨骨缺损愈合的影响健康雄性Wistar大鼠,108只,随机分为三组:空白组,常规饲养两周后于下颌骨体部制备下颌骨骨缺损;牙周炎组,建立牙周炎模型两周后于下颌骨体部制备下颌骨骨缺损;牙周炎+rhTNFR:Fc组,建立牙周炎模型两周后于下颌骨体部制备下颌骨骨缺损,并给予rhTNFR:Fc颈部皮下注射三天一次(2.5 mg/kg),直至处死实验动物。分别于术后1周、2周、4周、8周处死实验大鼠。采取腹主动脉血分离血清,ELISA法检测外周血血清TNF-α水平;分离缺损区下颌骨骨组织,Real-time PCR检测下颌骨缺损处成骨因子ALP、Runx2、BMP2、OCN和骨吸收因子NFATc 1 mRNA的表达水平;Western blot检测成骨因子Runx2和OCN蛋白表达水平;HE染色分析骨缺损区新骨形成情况,免疫组织化学染色观察成骨因子Runx2和OCN在骨缺损处的表达和分布情况;TRAP染色观察下颌骨缺损处破骨细胞活动,计算破骨细胞数并进行统计学分析。3.非手术牙周治疗对牙周炎大鼠下颌骨骨缺损愈合的影响取健康雄性Wistar大鼠72只,采用正畸结扎丝结扎双侧上颌第一磨牙加局部LPS注射的方法构建大鼠实验性牙周炎模型,随机分为两组:牙周炎组,建立牙周炎模型两周后制备下颌骨骨缺损;牙周治疗组,建立牙周炎模型两周后制备下颌骨骨缺损,同时给予牙周刮治(洁治+刮治+根面平整),3%过氧化氢溶液+生理盐水交替冲洗,上碘甘油。分别于术后1周、2周、4周、8周处死实验动物。采取腹主动脉血,分离血清,ELISA法检测外周血血清TNF-1水平。分离缺损区下颌骨骨组织,Real-time PCR检测下颌骨缺损处成骨因子Runx2、BMP2、OCN和骨吸收因子NFATc1 mRNA的表达情况;Western blot检测成骨因子Runx2及OCN的表达水平;HE染色观测骨缺损区新骨生成情况,免疫组织化学染色法观察成骨因子Runx2和OCN在骨缺损处的表达和分布情况,分析光密度值;TRAP染色观察下颌骨骨缺损处破骨细胞活动,计算破骨细胞数,并进行统计学分析。结果1.大鼠实验性牙周炎模型的建立ELISA结果显示,正畸结扎丝结扎大鼠双侧上颌第一磨牙加局部LPS注射的方法建模2周后,外周血血清TNF-α浓度显著升高(70.78±5.6 pg/ml),术后3周、4周,血清TNF-1水平与2周组无明显统计学差异(p>0.05)。体视显微镜观察发现,2周组实验动物釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离在第一磨牙为1.159±0.085 mm,在第二磨牙为0.671±0.056 mm,明显大于1周组实验动物(p<0.05),但3周组、4周组实验动物与2周组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。HE染色结果显示,2周组实验动物可见明显的牙槽骨吸收,尤以第一磨牙远中和第二磨牙近中最为明显。2.牙周炎对实验大鼠下颌骨骨缺损愈合的影响ELISA结果显示,术后1周、2周、4周、8周,牙周炎组外周血血清TNF-1水平均明显高于空白组(p<0.05),但牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。Realtime-PCR结果显示,牙周炎组成骨相关基因ALP、BMP2、Runx2和OCN的表达水平明显低于空白组(p<0.05),而骨吸收因子NFATc1 mRNA的表达(1周、2周、4周)水平显著高于空白组(p<0.01);牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比,差异无统计学意义(p>0.05)。Western blot结果显示,牙周炎组下颌骨缺损区新生骨组织中Runx2的表达量明显低于空白组(术后1周,2周,4周),表达于成骨晚期的OCN同样低于空白组(术后2周,4周);而牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比,两者的表达均无统计学差异(p>0.05)。缺损区骨组织HE染色发现,术后2周、4周,牙周炎组新生骨骨量显著低于空白组(p<0.05),牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比,无明显统计学差异(p>0.05)。对缺损区骨组织的免疫组织化学染色结果显示,Runx2和OCN广泛表达于成骨细胞、骨细胞和成纤维细胞;牙周炎组两种蛋白的表达水平均明显低于空白组,牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比差异无统计学意义。TRAP染色结果表明,术后1周、2周,牙周炎组缺损区TRAP+破骨细胞数显著高于空白组(p<0.05),而牙周炎+rhTNFR:Fc组与空白组相比无统计学差异(p>0.05)。3.非手术牙周治疗对牙周炎大鼠下颌骨骨缺损愈合的影响取实验动物腹主动脉血分离血清,ELISA检测发现,术后1周,牙周治疗组外周血血清TNF-α浓度高于牙周炎组,而术后2周、4周、8周,牙周治疗组则明显低于牙周炎组(p<0.01)。Real-time PCR结果显示,牙周治疗组缺损区成骨因子ALP、Runx2、OCN的表达水平明显高于牙周炎组(p<0.05);而对于骨吸收因子NFATc1,牙周治疗组在术后1周明显高于牙周炎组,随着时间的推移逐渐降低,至术后4周则呈现低于牙周炎组的趋势。Western Blot分析显示,术后1周,牙周治疗组下颌骨缺损区骨组织Runx2的表达低于牙周炎组,随着牙周状况的改善,术后2周、4周明显高于牙周炎组(p<0.05);对于缺损区骨组织OCN的表达,术后2周、4周,牙周治疗组的表达水平均明显高于牙周炎组。术后8周,牙周炎组和牙周治疗组下颌骨缺损区Runx2和OCN的表达均无明显统计学差异(p>0.05)。HE染色结果显示,牙周炎组和牙周治疗组下颌骨缺损处新骨的形成量均随着时间推移而逐渐增加。术后2、4周,牙周治疗组的新骨形成量明显高于牙周炎组(p<0.05);术后8周,两组无明显统计学差异(p>0.05)。免疫组化结果显示,术后1周,牙周治疗组下颌骨缺损区骨组织Runx2+细胞数明显低于牙周炎组;术后2周、4周,则显著高于牙周炎组(p<0.01)。下颌骨缺损区骨组织OCN光密度分析结果显示:术后2周、4周,牙周治疗组下颌骨骨缺损区MOD值明显高于牙周炎组;术后8周,牙周治疗组和牙周炎组OCN蛋白表达量无统计学差异(p>0.05)。对大鼠下颌骨缺损区骨组织切片进行TRAP染色,发现术后2周牙周治疗组下颌骨缺损区破骨细胞阳性细胞数显著低于牙周炎组(p<0.05)。术后4周,两组间差异无统计学意义(p>0.05)。结论1.正畸结扎丝结扎双侧上颌第一磨牙加局部LPS注射的方法2周即可成功建立大鼠实验性牙周炎模型。2.牙周炎导致血清炎性介质水平升高,打破成骨-破骨平衡,对大鼠下颌骨骨缺损愈合起到一定的抑制作用。3.在牙周炎致大鼠下颌骨骨缺损愈合延迟过程中,TNF-α可能起到关键作用。4.牙周非手术治疗对牙周炎大鼠下颌骨骨缺损的愈合起促进作用。