柿单宁特征结构单元基于细胞膜脂质筏受体抑制前脂肪细胞3T3-L1分化的分子机制

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本研究室前期研究结果表明,柿单宁特征结构单元A-ECG dimer和A-EGCG dimer可能是柿单宁抑制脂肪细胞分化的关键结构单元,但其作用机制不详。本文旨在进一步探究柿单宁特征结构单元A-ECG dimer和A-EGCG dimer基于细胞膜脂质筏受体抑制前脂肪细胞3T3-L1分化的分子机制。利用细胞体系以及体外合成荧光脂质体比较了四种柿单宁特征结构单元与细胞膜的相互作用强度和差异并关联其抑制前细胞脂肪细胞分化的活性。利用分子动力学理论技术和超高分辨率扫描电镜,原子力显微镜,激光共聚焦显微镜,流式细胞仪,实时荧光定量PCR(RT-PCR),蛋白质免疫印迹(Western blot)等实验分析技术探究了柿单宁特征结构单元A-ECG dimer和A-EGCG dimer对细胞膜脂质筏结构的破坏作用,对胰岛素受体(Insulin receptor,IR)和类胰岛素生长因子受体(Insulin-like growth factor-1 receptor,IGF-1R)在脂质筏的分布和活化的影响,以及探究了脂质筏内胆固醇以及受体67 kDa Laminin receptor(67LR)是否为A-ECG dimer和A-EGCG dimer抑制前脂肪细胞3T3-L1增殖分化的靶标。主要研究结果如下:1.柿单宁特征结构单元抑制前脂肪细胞3T3-L1的成脂分化与其对细胞膜的干扰能力的相关性。我们在3T3-L1细胞体系中发现四种柿单宁特征结构单元A-ECG dimer,A-EGCG dimer,A-EC dimer和B-EC dimer抑制前脂肪细胞3T3-L1分化的能力显著不同。其中,A-ECG dimer和A-EGCG dimer抑制细胞分化的能力最显著,A-EC dimer也能一定程度抑制细胞分化,但效果远远不如A-ECG dimer和A-EGCG dimer,而B-EC dimer对细胞分化几乎没有抑制作用。基于此,我们比较了四种二聚体与细胞膜的相互作用,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer能够破坏细胞膜表面的形态,引起细胞膜的凹陷和穿透。同时,A-ECG dimer和A-EGCG dimer还能够显著降低细胞膜的流动性,增加细胞膜的水合性以及通透性。而A-EC dimer和B-EC dimer对细胞膜的作用不明显甚至没有作用。我们发现四种柿单宁特征结构单元抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的能力与其对细胞膜的干扰能力高度正相关。采用化学计量软件分析了四种二聚体的分子化学性质,比较了四种二聚体的疏水性,表面极性拓扑区域以及氢键形成能力,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer具有更大的疏水性参数,更易与细胞膜作用;其次,其形成氢键的能力远高于A-EC dimer和B-EC dimer。四种二聚体分子的这种化学性质差异或许导致了其与细胞面膜相互作用的差异。2.柿单宁特征结构单元和体外合成的二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC)脂质体的相互作用与其抑制前脂肪细胞3T3-L1的成脂分化效果的相关性。为了进一步验证四种二聚体与细胞膜相互作用的差异,我们体外合成了DPPC脂质体来模拟细胞膜,利用荧光猝灭,荧光偏振,超滤法,差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)等探究了四种二聚体在磷脂膜的聚集、分布、定位以及与细胞膜的亲和力。A-ECG dimer和A-EGCG dimer不仅能够聚集在脂质体表面,还可通过分子中的特定基团插入脂质体内部,从而猝灭脂质体内部的荧光探针;而A-EC dimer和B-EC dimer基本只能作用于脂质体表面,只猝灭定位于脂质体表面的荧光探针。DSC方法也证明了A-ECG dimer和A-EGCG dimer不仅能够改变脂质体表面的分子性质还能改变脂质体内部的分子性质,而A-EC dimer和B-EC dimer只改变脂质体表面的分子性质。而静态猝灭与超滤法都表明A-ECG dimer和A-EGCG dimer的与脂质体的亲和力远远高于A-EC dimer和B-EC dimer,其中,A-ECG dimer与脂质体的结合常数是B-EC dimer与脂质体的结合常数的160倍。而荧光偏振的结果也说明A-ECG dimer和A-EGCG dimer显著降低细胞膜的流动性,而A-EC dimer和B-EC dimer对细胞膜流动性的影响不显著。从结果来看,四种二聚体与脂质体作用的趋势是A-ECG dimer>A-EGCG dimer>A-EC dimer>B-EC dimer,这与其抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的能力高度正相关。3.分子动力学模拟验证柿单宁特征结构单元与细胞膜的相互作用以及构效关系分析。为了进一步探究四种二聚体与细胞膜作用的差异以及分子机制,我们利用分子动力学模拟的方法从原子角度对这种作用差异进行构效分析。结果发现,四种二聚体主要是通过氢键与磷脂双分子层结合,而A-ECG dimer和A-EGCG dimer比A-EC dimer和B-EC dimer能够与磷脂膜形成更多的氢键,而且A-EC dimer和B-EC dimer基本只能与磷脂膜表面的氧原子O7,O9,O10,O11形成氢键,而A-ECG dimer和A-EGCG dimer不仅能够与磷脂膜表面氧原子形成氢键,分子中的没食子酰基还能够插入到磷脂膜内部,与磷脂膜内部的氧原子O14,O16,O33,O35形成氢键。A-ECG dimer和A-EGCG dimer与磷脂双分子层具有更低的结合能,说明其与磷脂膜具有更高的亲和力。其次,能量分解发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer分子中的两个没食子酰基贡献了总结合能的50%。分析二聚体对磷脂膜性质的影响发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer显著降低了磷脂膜的横向扩散以及脂质的有序排列。理论模拟的结果完全验证了我们前两章的实验结果。四种二聚体与磷脂膜作用的趋势是A-ECG dimer>A-EGCG dimer>A-EC dimer>B-EC dimer。A-ECG dimer和A-EGCG dimer中的没食子酰基对其与磷脂膜的相互作用起到了至关重要的作用,分子中的两个没食子酰基插入到磷脂膜内部,与磷脂膜内部的氧原子O14,O16,O33,O35形成氢键,从而一定程度上显著的改变了磷脂膜的性质。4.柿单宁特征结构单元A-ECG dimer与A-EGCG dimer通过结合细胞膜脂质筏胆固醇破坏脂质筏结构抑制前脂肪细胞3T3-L1的分化。基于A-ECG dimer和A-EGCG dimer显著的干扰细胞膜作用,而脂质筏作为细胞膜上募集传递各种信号的重要微区域,我们继续探究了A-ECG dimer和A-EGCG dimer对脂质筏的影响。体外合成的“类脂质筏”(Lipid rafts-like)脂质体结果表明A-ECG dimer和A-EGCG dimer能够显著与“类脂质筏”脂质体作用。在3T3-L1细胞体系,通过荧光探针标记和激光共聚焦观察,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer能够减少脂质筏胆固醇,破坏脂质筏完整结构。通过与脂质筏胆固醇结合试剂(β-MCD和Filipin)抑制3T3-L1细胞分化的机制做对比,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer抑制细胞分化的机制与β-MCD和Filipin完全一致,都是通过干扰细胞周期,阻碍细胞有丝分裂,抑制下游靶基因PPARγ,SREBP1C,C/EBPα的表达,下调FAS,SCD1等脂肪生成相关基因,减少细胞内脂肪的积累,最终阻碍前脂肪细胞的终端分化。A-ECG dimer和A-EGCG dimer与β-MCD和Filipin能够协同抑制细胞分化进一步说明A-ECG dimer和A-EGCG dimer可能是作用于脂质筏胆固醇,破坏了脂质筏结构,从而抑制了细胞分化。我们采用理论模拟的方法来验证上述的实验结果,对构建的POPC/POPE/CHOL磷脂双分子层进行了100ns的非限制性动力学模拟,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer与POPC/POPE/CHOL磷脂双分子层的相互作用强于单独的POPC/POPE磷脂双分子层,并且二聚体能够同时与磷脂膜上的胆固醇形成多重氢键。理论的结果进一步证实了A-ECG dimer和A-EGCG dimer与脂质筏胆固醇的作用。采用Western blot技术,发现A-ECG dimer和A-EGCG dimer通过结合脂质筏胆固醇,破坏脂质筏结构,阻碍了由脂质筏介导的胰岛素受体(IR)以及类胰岛素生长因子受体(IGF-1R)从非脂质筏区域向脂质筏区域的迁移以及抑制了受体在脂质筏区域的自身磷酸化。5.柿单宁主要特征单元A-ECG dimer和A-EGCG dimer抑制前脂肪细胞3T3-L1的成脂分化与脂质筏受体67LR的相依性关系。67LR已知为细胞膜表面EGCG的分子受体。通过是否用anti-67LR抗体预处理细胞,比较处理前后A-ECG dimer和A-EGCG dimer对细胞周期,增殖,胰岛素信号通路以及细胞终端分化的影响。A-EGCG dimer通过67LR途径干扰了细胞的周期,抑制了细胞有丝分裂,胰岛素信号通路(IRS1/PI3K-AKT/MEK-ERK)的活化,以及细胞的终端分化。A-ECG dimer也能干扰细胞的周期,抑制细胞有丝分裂,胰岛素信号通路(IRS1/PI3K-AKT/MEK-ERK)的活化,以及细胞的的终端分化,但此过程并不依赖于67LR途径。分子对接结果发现A-EGCG dimer和EGCG类似,其中一个没食子酰基插入到蛋白的疏水口袋,与Trp176、Arg180、Arg184形成三个氢键,而A-ECG dimer是一个邻苯二酚环插入疏水口袋与His169形成一个氢键。而整个氨基酸序列中,回文序列169-180号残基参与到小分子抑制剂与67LR的相互作用中。而我们的对接结果表明,EGCG和A-EGCG dimer的没食子酰基能够与该结合位点作用而A-ECG dimer的邻苯二酚环作用有限。分子对接结果进一步证实了我们的实验结果。
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