研究背景不孕不育已成为一个影响人类健康与社会发展的全球性医学和社会问题,在不孕不育的患者中,男性因素约占50%,称为不育症。夫妇同居1年以上,有规律性生活,同时未采取任何避孕手段,男方因素引起女方未能怀孕者称为男性不育。近年,男性不育发病率出现了明显的增加。导致男性不育发生的原因较多,根据其影响生殖环节不同,主要有三大类因素:睾丸前因素、睾丸因素、睾丸后因素。其中临床上最常见的是无精症及严重弱精子症,而精液质量呈逐渐下降是引起无精子症或者严重弱精子症的一个重要原因。越来越多的研究发现,氧化应激损伤是影响精液质量一个重要因素,氧化应激男性不育的共同特征之一,它可能是引起男性不育的重要因素。过氧化氧化还原蛋白2(PRDX2)是过氧氧化还原酶家族一员,主要负责中和细胞内活性氧水平,可通过调节ROS参与细胞过程如细胞的存活,增殖和细胞凋亡。已有文献报道证实PRDX2和精子功能相关。然而,PRDX2在正常的精子发生过程发挥什么样的具体作用,其表达水平是否与睾丸的生精功能相关,其作为抗氧化蛋白在精子发生中的机制尚不明确。研究目的1、检测PRDX2在生精功能正常及生精功能不良的人睾丸组织中的表达,并评价其临床意义;2、检测PRDX2在生精功能正常及生精功能不良C57小鼠动物模型中的表达,并分析其与睾丸生精功能的相关性;3、探讨PRDX2对小鼠睾丸生精细胞的生物学功能的影响及作用机制。方法1、应用免疫组化检测已明确病理诊断的生精功能正常(N=40)和生精功能不良(N=60)人类睾丸组织中PRDX2的表达情况;应用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测已明确病理诊断的生精功能正常(N=5)和生精功能不良(N=5)睾丸标本PRDX2的表达;2、Western blot、RT-PCR、IHC检测PRDX2在不同周龄的小鼠中表达水平;构建小鼠生精功能不良动物模型,HE染色观察小鼠睾丸组织形态的变化,判断其生精功能变化;并采用IHC技术检测白消安处理组及对照组小鼠睾丸组织中PRDX2的表达水平,评价PRDX2表达水平与小鼠睾丸生精功能的关系。3、采用siRNA干扰技术以及慢病毒稳定干扰技术,在小鼠精母细胞(GC2-spd)和支持细胞(TM4)中敲低PRDX2表达,检测PRDX2表达对GC2-spd和TM4细胞的周期、增殖、凋亡、抗氧化能力的影响。4、Western blot检测PRDX2表达下调对下游细胞周期及凋亡相关信号通路的影响。研究结果1、IHC结果显示PRDX2在生精功能不良人睾丸组织(28.3%)中的表达显著低于生精功能正常睾丸组织(72.5%,P<0.001);RT-PCR提示PRDX2在生精功能不良人睾丸组织中的表达显著低于生精功能正常睾丸组织。2、在不同周龄的C57小鼠中,PRDX2在其睾丸组织的表达水平随周龄增加而增加,并在成年的小鼠达到稳定水平。在生精功能不良C57小鼠模型中,IHC结果显示RDX2的表达水平在生精功能正常组的C57小鼠中的表达水平,要高于生精功能不良组的C57小鼠的睾丸组织。3、体外功能实验,流式结果显示,稳定干扰PRDX2的表达后,GC2-spd和TM4细胞G1期细胞增多,S期细胞减少,GC2-spd和TM4细胞凋亡增多;CCK-8及EdU实验显示,稳定干扰PRDX2的表达后,抑制GC2-spd和TM4细胞增殖,GC2-spd和TM4细胞抵抗H2O2诱导氧化应激能力下降,与对照组相比,差异具有统计学意义。4、Western blot结果表明,稳定干扰PRDX2后,细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(P21),细胞周期蛋白cydinD1、cydinE1表达下调,促凋亡相关蛋白:Bax、Caspase-3表达水平上调,Caspase-9无明显变化,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下调。研究结论1、PRDX2在生精功能正常的睾丸组织的表达水平要强于睾丸生精功能不良,PRDX2可能与睾丸生精功能发生过程相关。2、PRDX2表达水平与生精细胞的增殖能力、凋亡及周期进程、抗氧化能力相关;PRDX2发挥生物学功能的机制与其表达下调P21/Cyclin D1/Cyclin E1周期调控通路、Caspase 3/Bax/Bcl-2凋亡相关信号通路相关。