【摘 要】
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腺相关病毒（Adeno-Associated Virus,AAV）载体凭借高整合率和非致病性的优势,在基因治疗中得到广泛使用且需求量巨大。目前常用三质粒系统在贴壁HEK293细胞中转染扩增AAV载体,但该工艺存在产量有限、质量控制困难、难于放大等缺点。利用悬浮HEK293细胞转染扩增AAV载体的方式过程简便、易于放大,具有诸多优点,但目前普遍存在转染效率不高、生产AAV的滴度较低等问题,限制其广泛
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腺相关病毒（Adeno-Associated Virus,AAV）载体凭借高整合率和非致病性的优势,在基因治疗中得到广泛使用且需求量巨大。目前常用三质粒系统在贴壁HEK293细胞中转染扩增AAV载体,但该工艺存在产量有限、质量控制困难、难于放大等缺点。利用悬浮HEK293细胞转染扩增AAV载体的方式过程简便、易于放大,具有诸多优点,但目前普遍存在转染效率不高、生产AAV的滴度较低等问题,限制其广泛应用。针对无血清悬浮培养扩增AAV中的诸多问题,本文首先考察了悬浮HEK293细胞转染效率的影响因素,并对培养基中关键组分抑制HEK293细胞转染的原因进行分析,在此基础上对悬浮细胞扩增AAV的过程进行优化,以建立HEK293细胞悬浮培养高效扩增AAV的过程。首先通过探究孵育条件和培养基组分对转染效率的影响,发现在孵育体积比为1/20的DMEM培养基中孵育5-15min可获得较高的转染效率。在此基础上考察了培养基中铁供给方式和组分A对转染效率的影响,发现当添加10μmol/L柠檬酸铁铵和0.4mg/L组分A时,可在不影响细胞正常生长和长期传代的前提下使细胞转染效率达到98.04%。进一步对关键组分影响转染过程和目的基因表达的原因进行了分析,结果表明柠檬酸根和铁离子同时存在时才会抑制HEK293细胞转染,且过高浓度的柠檬酸铁铵和组分A使PEI-DNA复合物的粒径变大,进入细胞的复合物数量减少。以此为基础,进一步对细胞培养、质粒转染和病毒扩增过程进行了优化,为了满足细胞生长维持和AAV扩增的营养需求,通过添加营养强化剂和转染后流加的策略,设定转染时的细胞密度为4×106cells/ml,收获的AAV滴度可达3.49×1011Vg/ml,较原086培养基和进口培养基扩增的病毒滴度分别提高了 7.84和2.08倍。本文的研究结果可为基于HEK293细胞悬浮培养的腺相关病毒扩增的广泛应用奠定基础,也为AAV大规模生产过程的设计与优化提供了科学指导。
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