研究背景全球约20亿人感染乙型肝炎病毒(HBV),其中罹患慢性乙型肝炎患者约2.4亿人,研究发现HBV感染是肝细胞癌(HCC)的主要危险因素,HBV携带者罹患HCC的相对危险度较正常人增加100倍以上。HCC的5年生存率约10%,发病率居第5位,病死率居第3位,80%左右的HCC是从肝炎、肝纤维化、肝硬化发展而来。目前临床诊断肝癌的分子标志物多用血清甲胎蛋白(AFP),但是AFP只在60%-70%的HCC中升高,近三分之一的HCC患者AFP水平正常。基于此,临床急需寻找能和AFP结合使用的肿瘤分子标志物,以提高肝癌血清学诊断的阳性率。组织型转谷氨酰胺酶(TG2)是一种钙离子依赖的、通过转酰胺作用催化蛋白质修饰的诱导型转胺酰基转移酶,此外在细胞凋亡、粘附、增殖和信号传导中有着重要作用,而且与某些实体肿瘤的转移有关。目前关于TG2的研究主要集中在乳腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、结肠癌、黑色素瘤等恶性肿瘤,它在HBV阳性HCC中的表达和作用机制尚无相关研究报道。研究目的本论文拟从组织、细胞、动物和通路4个层面,深入探讨TG2在HBV阳性HCC中的作用和机制,为寻找诊断肝癌的分子标志物和靶向治疗提供实验依据。研究方法第一章TG2在HBV阳性HCC中的表达及作用1、对105例HBV阳性HCC组织及癌旁组织进行免疫组化、RT PCR和western blot实验,观察TG2在肝癌及配对癌旁组织中的表达。2、用shRNA敲减HepG2.2.15和HEP3B细胞系,通过MTT实验、划痕实验、Transwell实验观察肝癌细胞增殖、迁移和侵袭表型的变化。第二章TG2在AFP阴性的HBV阳性HCC中的表达及作用1、对58例HBsAg阳性、HBVDNA阴性、AFP阴性的肝癌及配对癌旁组织免疫组化分析,观察TG2在AFP阴性的HBV阳性肝癌和癌旁组织中的表达。同时提取总RNA,通过RT PCR和western blot方法检测肝癌及配对癌旁组织中TG2的表达。2、miR-TG2慢病毒载体构建及病毒包装,转染HepG2.2.15和Hep3B细胞,培养和复苏HBV阳性的肝癌细胞系(HepG2.2.15、Hep3B),用RTPCR、CCK8、Transwell和流式双染实验,观察慢病毒感染细胞前后TG2的表达、肝癌细胞的活性、增殖、侵袭、迁移和凋亡情况。第三章TG2shRNA1转染HepG2.2.15细胞前后对裸鼠成瘤的影响1、用TG2shRNA1敲减HepG2.2.15和Hep3B细胞系,根据细胞实验的结果筛选稳定株,选用4-6周龄BALB/c Nude裸鼠做成瘤实验。2、每隔3～4天对肿瘤的大小进行测量,记录小鼠体重和肿瘤成长数据。剥离肿瘤后拍照称重,对成瘤组织行免疫组化、HE染色、tunel染色,了解成瘤病理结构和细胞凋亡情况。第四章TG2在HBV阳性肝细胞癌中的促瘤机制和通路初探利用NCBI、CST信号通路和Oncomine数据库,初步选定5种可能与TG2的促瘤作用有关的通路蛋白caspase3、caspase8、caspase9、TGF-β和NFkB,在HepG2.2.155细胞系、Hep3B细胞系和裸鼠成瘤组织中,通过Western blot和RT PCR分别从凋亡和增殖两个角度探寻TG2在HBV阳性HCC中的促瘤机制和信号通路。研究结果第一章IHC结果显示约70%的肿瘤标本具有TG2阳性表达,显著高于癌旁组织(22.86%),提示TG2在癌旁组织中的表达明显低于HBV阳性的HCC组织,在新鲜冰冻的HBV阳性HCC组织中TG2 mRNA的表达水平高于配对的癌旁组织(P<0.05),在与HBV阳性的肝癌细胞系中TG2的表达显著升高(P<0.05);研究发现与癌旁组织相比,TG2mRNA和蛋白在HBV阳性HCC组织中的表达明显增加,转录和蛋白水平均上调;发现对HBV阳性的肝癌细胞系HepG2.2.15和Hep3B中的TG2靶向敲减后,可以抑制肝癌细胞体外增殖、迁移和侵袭效应。第二章IHC和RT PCR结果均提示TG2在AFP阴性的、HBV阳性HCC组织中高表达,且显著高于配对的癌旁组织(P<0.05);在AFP阴性的、HBV阳性HCC组织中TG2 mRNA的表达水平高于配对的癌旁组织(P<0.05);通过筛选稳定的干扰序列,包装慢病毒到LV5载体上,分别感染HBV阳性的肝癌细胞和HBV非相关肝癌细胞,发现TG2在HBV阳性肝癌细胞中表达高于HBV非相关肝癌细胞(P<0.05);CCK8实验提示靶向敲减TG2后肝癌细胞增殖能力减弱;流式双染实验证实靶向敲减TG2后,肝癌细胞的凋亡能力增加。第三章TG2-NC组的裸鼠体重下降显著(P<0.05),且裸鼠成瘤体积明显大于敲减组(P<0.05),HE染色发现TG2敲减组肿瘤组织较为正常,坏死组织较少,而对照的正常组和NC组坏死组织较多,结构紊乱,可见核皱缩和细胞溶解。Tunel检测成瘤组织的调亡情况,NC组阳性细胞率为19.34±2.43,而TG2敲减组为6.56±2.13(P<0.05),提示敲减TG2后可以增加肿瘤细胞凋亡,进而影响成瘤生长。Western blot检测发现NC组中TG2蛋白的表达高于TG2敲减组,提示TG2靶向性敲减后,可以抑制BALB/c裸鼠成瘤生长,因此我们推测TG2有促进肿瘤细胞增殖、抗凋亡的作用。第四章 5种通路蛋白在Hep3B细胞和HepG2.2.15细胞系(正常组、TG2shRNA1空载体转染组,TG2shRNA1转染组的)中的表达显示,在内参和目标蛋白总量基本一致的前提下,Hep3B细胞的TG2靶向敲减组中Caspase3表达下降,余4组通路蛋白均有显著升高(P<0.05);在HepG2.2.15细胞的TG2 敲减组中,Caspase3 表达升高、Caspase8、Caspase9、NFκB、TGFβ这 4种通路蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)。在TG2敲减组的成瘤组织中,凋亡相关蛋白Caspase3、Caspase8、Caspase9、TGFβ和促增殖蛋白NFκB表达均下调。Western blot验证ERK1/2抗体在裸鼠成瘤的组织中的表达,发现在TG2敲减组中的ERK1/2表达显著下降(P<0.05),提示TG2的促瘤作用还可以通过ERK1/2-NFκB通路调节增加肿瘤细胞的增殖。HBV阳性肝细胞癌中同时存在凋亡和增殖两种作用,既有凋亡蛋白表达上调,促进肝癌细胞凋亡,又有增殖相关的蛋白表达上调,促肝癌细胞增殖,但细胞内增殖的作用占优势。本研究首次发现TG2在肝细胞癌中通过ERK1/2-NFκB通路激活调节肿瘤细胞增殖。研究结论TG2在HBV阳性HCC组织中较配对癌旁组织表达显著上调;TG2在HBV阳性的肝癌细胞系中表达明显高于非HBV阳性的肝癌细胞系,提示TG2可以结合AFP作为辅助诊断HCC的新型肿瘤标志物。敲减TG2可以抑制体外肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,增加肝癌细胞凋亡、抑制裸鼠成瘤生长,提示了 TG2在HBV阳性的肝癌细胞中有促进肿瘤恶性表型发展的作用。另外,TG2通过ERK1/2-NFκB通路调节肝癌细胞的增殖,可以作为未来治疗HCC的重要分子靶标。TG2参与肝癌迁移、侵袭、增殖、凋亡多种途径,为寻找新型肝癌分子标志物和肝癌分子靶向精准治疗提供了实验室依据。