论文部分内容阅读
西瓜是我国重要的水果,其种植面积、产量和消费量都居世界第一。西瓜病毒病的发生是阻碍西瓜产业可持续发展的重要因素之一。在侵染西瓜的几十种病毒中马铃薯Y病毒属病毒种类最多、发生分布最广、危害最严重,其中尤以小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒和番木瓜环斑病毒-西瓜株系最为常见,并且在田间发生多为复合侵染,目前尚缺乏有效的防治方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物自身的一种防御机制,在植物抗病毒方面发挥着重要的作用。双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)可以诱导植物产生RNAi,对植株外用dsRNA时可以发挥作用。基于该原理,本研究针对ZYMV、WMV和PRSV-w 3种病毒,建立了能够生产以病毒为来源的dsRNA的原核表达体系,探明了病毒不同片段dsRNA、不同的施用时间对各病毒病的预防和治疗效果,并通过获得嵌合表达3种病毒目的片段的dsRNA,实现同时控制3种病毒的目的。主要研究结果如下:(1)构建了高效的dsRNA原核表达和释放体系。根据实验室已有的ZYMV、WMV和PRSV-w的基因组序列,分析各病毒的序列保守性,并以此为基础分别扩增ZYMV的3′UTR、6K2、HC-Pro、NIb、P3和WMV的CP、CI、NIb、P1、P3以及PRSV-w的CP、HC-Pro、NIa、NIb和P3基因长度为200-300 bp的片段,以pGEM-T Easy和L4440两种载体为骨架构建了重组载体,转化大肠杆菌RNAⅢ酶缺陷型菌株HT115,实现了dsRNA的原核表达。在此基础上,对dsRNA的诱导表达和释放条件进行了优化,发现IPTG诱导浓度为4 mM、诱导时间为5 h、超声波细胞破碎仪输出功率为300 W的条件下破碎5 min,细胞可以有效产生和释放dsRNA。(2)分别评价了3种病毒不同基因片段dsRNA的预防和治疗效果。在西瓜植株上采用喷施的方法施用dsRNA,设计先喷施dsRNA、后接种病毒进行预防试验,统计分析接种植株的病情指数评价预防的效果,发现ZYMV的HC-Pro、3′UTR、6K2、NIb和P3的相对防效分别为86.5%、76.4%、70.7%、63.4%和41.8%;WMV的CI、NIb、P1、CP和P3的相对防效分别为76.7%、75.6%、69.8%、68.6%和65.2%;PRSV-w的HC-Pro、NIa、P3、CP和NIb的相对防效分别为65.4%、54%、50.7%、48.7%和47%。说明ZYMV的HC-Pro片段、WMV的CI片段以及PRSV-w的HC-Pro片段对各病毒的预防效果最好。设计先接种病毒、后喷施dsRNA的治疗试验。分析发现外源喷施dsRNA没有明显的治疗效果,同时统计发现该方法防治病毒病的时效性较差。(3)建立了嵌合表达3种病毒基因片段的dsRNA原核表达体系,并进行了抗病毒效果评价。利用同源重组的方式将3种病毒的不同基因片段进行融合,获得能够同时表达3种病毒基因片段的原核表达体系。通过外源喷施和3种病毒混合摩擦接种,证实该方法可以用于3种病毒的预防,相对防效能达到50.9%,在一定程度上解决了该方法防效单一的缺点。