异戊烯基转移酶是一类参与异戊烯基活性化合物合成的关键酶,根据其存在形式可以分为膜结合型和可溶型两种。可溶型异戊烯基转移酶的催化过程不需要依附于生物膜,因此具有更广阔的应用前景。但是,可溶型异戊烯基转移酶大多来源于链霉菌,异源表达后会存在可溶性水平低、催化活力弱和抗逆性差等不足,尤其是在高值化学品的合成过程中。大肠杆菌表达系统有着菌体生长快、蛋白表达量高、发酵条件温和以及遗传背景清楚等优势,在蛋白异源表达和酶工程改造等方面具有很高的潜力和优势。本文以雪白色链霉菌来源的可溶型异戊烯基转移酶NovQ为研究对象,以大肠杆菌为宿主菌,进行了该酶的高效异源可溶性表达,利用化学法合成了酶催化所需底物,通过定点突变和固定化的手段提高了该酶的催化活性,为后续的进一步研究奠定了基础。本文通过对促溶标签的种类、促溶表达方式、诱导表达条件和蛋白纯化参数等的优化,建立了一种简单快速获取活性NovQ重组酶的方法。结果显示,选用MBP为促溶标签,E.coli Rosetta(DE3)为宿主菌,在20℃诱导12 h后,MBP-NovQ的产量为140 mg/L,其中可溶性组分占86%。将镍柱亲和层析和TEV蛋白酶酶切相结合,获得的不含标签的可溶性NovQ的纯度达到90%以上。由于NovQ体外催化的底物是不稳定的,因此我们采用酶-化学偶联法生产目标产物。结果表明,利用二甲基烯丙基溴和甲萘醌为原料可以分别合成纯度较高的DMAPP和甲萘醌氢醌。氧化实验结果表明,甲萘醌氢醌暴露在空气中1h可以完全被氧化。原始NovQ的体外催化结果显示其能够催化合成唯一的产物MK-1,液相出峰时间为4.9 min。此外,尝试通过HPLC、UV光谱、LC-MS和1H-NMR对体外催化合成的样品进行检测和鉴定,证明合成了维生素K2同系物MK-1。计算机模拟实验得到了 NovQ与底物的关键作用位点为Glu281,以此为突变目标得到了阳性突变株E281Q,其相对活力是原始NovQ的2.05倍。对体外催化条件进行优化,32℃,pH 8,Mg2+浓度为2.5 mM,甲萘醌氢醌浓度为0.5 mM,DMAPP浓度为0.25 mM是最佳催化条件。结合构建外源MVA途径和添加芳香族底物,实现了利用工程菌S2全细胞合成MK-1,在相同的催化条件下,选用MVA-O为诱导培养基,诱导24 h后NovQ蛋白产量为61 mg/L,MK-1的产量为4.7 mg/L。固定化实验利用“三步法”制得了纳米粒子CMNs,进一步吸附NovQ后得到NCMNs,采用 FI-RT、XRD、TGA、VSM、XPS 和 SEM 对 CMNs 和 NCMNs 进行了性质表征,证实了蛋白成功固定在纳米载体上,且Fe3O4的化学性质没有变化。酶学实验显示固定化NovQ的抗逆性和稳定性都有所增加,当甲萘醌氢醌浓度高于2 mM时,固定化NovQ的活性是游离酶的1.45倍;当DMAPP浓度为1.5 mM时,固定化NovQ的相对活力为53%,是游离酶的4.8倍;固定化NovQ在4℃条件下储存40天后,残余活力超过65%;重复使用7个和10个循环后,固定化NovQ的残余活力分别为81%和64%。