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【目的】过度磷酸化的tau蛋白是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的病理特征神经元纤维缠结的主要组成成分。而目前普遍认为,ApoE中的ε4等位基因已经成为了AD最为主要的危险相关基因,且参与了AD的各种病理过程。到目前为止,学者们对apoE4与Aβ的关系已经进行了广泛的研究,然而apoE4与tau蛋白磷酸化的关系仍不是很清楚。故本文拟从在体和体外两个方面进行探讨。在体,用人源的APOE基因(ε3和ε4)置换小鼠的APOE基因,然后与apoE-/-/5xFAD转基因小鼠进行交配,从而培育出ApoE/5xFAD(简称EFAD)转基因小鼠。通过对EFAD转基因小鼠进行研究,拟在AD的遗传背景下观察内源性apoE的不同基因型(apoE3和apoE4)对5xFAD转基因小鼠的认知功能、tau蛋白磷酸化水平以及神经纤维形态的影响,并探讨引起tau蛋白磷酸化改变的可能上游机制。体外,通过对表达Aβ的N2a/APP695细胞株给予外源性apoE肽段及相关抑制剂干预,进一步证实在体所观察到的tau蛋白磷酸化及机制。最终为AD的治疗及新药的开发提供一定的理论依据。【方法】1、在体部分,本实验采用SPF级3月龄及7月龄雄性E3FAD转基因小鼠和E4FAD转基因小鼠,每组9-12只。首先,通过Morris水迷宫检测不同月龄不同APOE基因型转基因小鼠学习记忆能力是否存在差异。然后,通过改良的Marsland氏银染方法对大脑皮层神经纤维进行形态学染色,观察不同月龄APOE的不同基因型对小鼠神经纤维形态的影响;其次,通过Western blot和免疫组化的方法探索EFAD转基因小鼠大脑皮层的taupT205、taupS396、taupS404和taupT231的磷酸化水平及总tau的水平。接下来,通过Western blot的方法对tau蛋白磷酸化的相关激酶GSK3β和CDK5及其调节亚单位P35、P25的表达水平进行检测。最后,通过Western blot的方法对calpain-CDK5信号通路中calpain的表达情况进行了检测。2、体外部分,对稳定表达突变型APP695的小鼠神经母细胞瘤细胞株(N2a/APP695)予以200nM的外源性重组人apoE3和apoE4肽段干预24小时,因此实验分为apoe3干预组、apoe4干预组和溶媒对照组。首先,采用westernblot的方法对不同组taupt205、taups396、taups404和taupt231的磷酸化水平进行检测,验证动物实验中所观察到的现象是否能在体外进行模拟。然后,对tau蛋白激酶cdk5及其调节亚单位p35、p25的表达水平进行检测,同时进一步应用cdk5抑制剂进行干预,进一步在体外确认是否cdk5影响tau蛋白磷酸化。最后,对calpain的表达水平进行检测,从而证实其中所包含的机制。【结果】1、在体实验结果显示:a.行为学结果表明:在3月龄时,e3fad转基因小鼠与e4fad转基因小鼠之间的学习记忆能力无明显统计学差异;而在7月龄时,与e3fad转基因小鼠相比,e4fad转基因小鼠学习记忆能力明显下降,表现在前5天训练时寻找平台的潜伏期明显延长;第6天平台探索实验中,在平台所在象限停留时间明显缩短、穿越原平台所在位置的次数明显减少。b.marsland氏银染结果显示:在3月龄时,e3fad转基因小鼠与e4fad转基因小鼠的皮层神经纤维均比较完整,且走行很规律,但e4fad转基因小鼠的神经纤维稍增粗、深染,提示e4fad转基因小鼠的神经纤维已有轻微损害。然而,在7月龄时,e3fad转基因小鼠的神经纤维仍然完整且走行规律,但e4fad转基因小鼠的神经纤维已明显破坏,表现为神经纤维的断裂且排列的杂乱无序。c.westernblot和组化结果显示:与e3fad转基因小鼠相比,早在3月龄时,e4fad转基因小鼠大脑皮层taupt205的磷酸化水平明显增加;到7月龄时,e4fad转基因小鼠taupt205、taups396、taups404和taupt231的磷酸化水平均明显增加。且e4fad转基因小鼠脑内cdk5、p35、p25及calpian明显增高,但gsk3β活性在两组之间无明显的统计学差异。2、体外实验结果表明:a.给予n2a/app695细胞株200nm外源性重组人apoe3和apoe4肽段干预后,apoe4组taupt205、taups396、taups404和taupt231的磷酸化水平明显增加;cdk5、p35、p25及calpian的表达量也明显增加。b.在给予cdk5抑制剂后,taupt205、taups396、taups404和taupt231的磷酸化水平明显下降。【结论】1、apoe4所导致的tau蛋白磷酸化水平的增加早于学习记忆能力的下降。2、在5xfad转基因小鼠中,tau蛋白磷酸化水平的增加是由于cdk5活性升高所引起,而与GSK3β无关。3、ApoE4能够通过calpain-CDK5信号通路介导tau蛋白的过度磷酸化,从而破坏神经元的骨架结构,最终导致5xFAD转基因小鼠的认知功能损害。