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缺血性脑损伤是世界范围内致死和致残的主要原因之一,针对该疾病的药物开发也引起了越来越多的关注。脑缺血通常是由血栓或血栓栓塞性动脉闭塞引起的短暂或永久性的脑血流减少引起的。及时得恢复脑部血液的灌注而设计的溶栓治疗被认为是缺血性脑损伤的主要合理治疗策略。然而,溶栓治疗后再灌注往往导致病灶周边一系列的细胞、生化和代谢后果,包括细胞内活性氧(ROS)生成、钙超载、兴奋性细胞损伤和炎症,最终导致不可逆性脑损伤。脑缺血再灌注损伤的发病机制十分复杂,单一药物的治疗效果不佳,而联合给药很容易导致交叉反应和未知的副作用。中药保护剂的开发是脑缺血再灌注损伤及相关神经退行性疾病治疗的一个很有前途的方向。但因中药成分复杂导致其用传统研究方式难以阐明其作用机制及作用靶点。代谢组学和转录组学的结合是一种强有力的分析工具,通过鉴定出一系列的基因及代谢产物,可以揭示表型相关的基因功能和代谢途径。因此,本文旨在通过代谢组与转录组结合的方式揭示两种组学结果之间的联系和联合后的功能信息,从而阐明刺五加提取物治疗脑缺血再灌注损伤的机制。1.刺五加提取物治疗大鼠脑缺血再灌注的药效学研究为了研究研究刺五加提取物(ASE)对wistar大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用,将健康雄性Wistar大鼠分为6组,分别为假手术组(Sham)、模型组(I/R)、尼莫地平组(Nimodipine)及刺五加高剂量(ASE-H)组、刺五加中剂量(ASE-M)组、刺五加低剂量(ASE-L)组。各组给药15天后,采用改良Longa线栓法对大鼠脑中动脉进行栓塞,建立大鼠脑缺血再灌注模型。通过检测氧化应激指标,炎症细胞因子和组织细胞凋亡来说明ASE对脑缺血再灌注损伤的保护作用。结果显示,ASE能改善脑缺血再灌注损伤大鼠的病症,降低脑梗死面积百分比。苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)染色显示,模型组大鼠大脑顶叶皮层周围脑组织疏松水肿。神经细胞变性萎缩,核呈空泡状周围脱髓鞘改变。而给药组均有明显改善。TUNEL(脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法,TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)检测结果表明,I/R组顶叶皮层存在大量凋亡细胞,给药后细胞凋亡百分比显著减少。此外,ASE还能提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中超氧化歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性,降低丙二醛(Malondialdehyde,MDA)浓度,白介素6(Interleukin-6,IL-6),白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。因此,本研究证明ASE在脑缺血再灌注损伤中具有一定的保护作用,其作用机制可能与提高脑组织抗氧化能力和抑制炎症细胞因子过度分泌,以及抑制组织细胞凋亡有关。2.刺五加提取物治疗大鼠脑缺血再灌注的代谢组学研究为了从生物小分子层面研究ASE治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制,将健康雄性Wistar大鼠随机分为4组,分别为sham组、I/R组、Nimodipine组和ASE组。各组给药15天后,采用改良Longa线栓法对大鼠脑中动脉进行栓塞,建立大鼠脑缺血再灌注模型。通过检测氧化应激指标,炎症细胞因子和组织细胞凋亡来证明ASE对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,再通过对代谢产物的多元数据处理以及数据库的比对,来鉴定潜在的生物标记物。最终通过代谢通路的富集与分析来阐述刺五加提取物的治疗作用机制。结果表明,在药效方面:大鼠脑组织的组织形态学变化、行为学变化及脑缺血梗死面积百分比变化趋势均与之前药效实验部分相同。此外,ASE还能提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中SOD,GSH-Px活性及白介素10(Interleukin-10,IL-10)的水平,并显著降低MDA浓度,及IL-1β和TNF-α的水平。在代谢组学方面:使用Markerview 1.2.1导出LC-MS原始数据,经过数据归一化处理后进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)及正交偏最小二乘回归(orthogonal partial last squares regression discriminant analysis,OPLS-DA)分析,结果表明,两种模式下sham组、I/R组、ASE组及QC样本之间都能达到很好的分离。进一步筛选后通过与HMDB(Human metabolome database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等在线数据库进行比对,最终在LC-MS正离子模式下共鉴定出59个代谢产物,负离子模式下鉴定出7个代谢产物,其中11个代谢产物通过与标准品对照确定了其结构信息。将鉴定出的66个代谢产物导入MetaboAnalyst 4.0进行通路富集分析后,认为ASE是通过调节嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、色氨酸代谢通路中代谢产物的水平来治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的。3.刺五加提取物治疗大鼠脑缺血再灌注的转录组学研究为了从基因层面研究ASE治疗大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制,通过对Sham组、I/R组及ASE组每组3个重复脑组织样本,进行Total RNA提取与质检、序列分析文库的构建与评价、RNA-seq样品测序与筛选、参考序列比对分析、基因表达水平分析、基因表达差异分析等一系列数据处理和筛选,最终筛选出差异表达基因及显著富集的信号通路。结果表明I/R组与sham组比较,一共鉴定出基因21160个,从中筛选出2734个差异表达基因,其中上调基因1568个,下调基因1166个。而ASE组与I/R组比较,共鉴定出21184个基因,从中筛选出2141个差异表达基因,其中上调基因730个,下调基因1411个。另外,对Sham组、I/R组及ASE组进行PCA分析可以观察到各组之间明显分离。GO(Gene Ontology)基因注释分析及KEGG信号通路富集分析的结果显示,I/R组与Sham组比较一共富集出288条信号通路,其中显著富集117条;ASE组与I/R组比较一共富集出267条信号通路,其中显著富集102条。这当中的83条信号通路在两组数据中均被显著富集。最后,将鉴定出的66个代谢产物通过KEGG映射到83条显著信号通路中,对代谢产物与差异表达基因的相互关系进行分析,认为ASE通过显著调节嘧啶代谢通路中代谢产物脱氧胞苷(Deoxycytidine,DD)与基因Dck的水平达到治疗脑缺血再灌注的目的。此外,不饱和脂肪酸生物合成通路中代谢产物花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)与基因Acot的水平,以及鞘脂代谢通路中参与生成鞘脂激酶1的Sphk1基因和代谢产物二氢鞘氨醇(Sphinganine,SG)的水平也均被显著影响。