刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会致病性原虫,在人和动物的有核细胞内寄生和繁殖,引起人兽共患的弓形虫病。尤其对于孕妇、婴儿和免疫低下者感染后危害极大。目前已成为发展中国家乃至全世界关注的机会感染性疾病之一。弓形虫在宿主体内快速增殖以及所产生的炎症反应可导致宿主机体出现严重的组织损伤和临床症状。虽然许多抗生素对急性弓形虫病治疗有效,但这些药物本身会对患者产生一定的副作用。因此,找到一种新药,特别是一种既能抑制弓形虫增殖又几乎不会产生副作用的药物成为弓形虫病治疗的当务之急。弓形虫侵入宿主细胞后位于一个由纳虫泡膜包绕的纳虫泡内,位于纳虫泡内的虫体可通过分泌一些蛋白成分修饰纳虫泡内环境,从而维持自身生长发育需求。其中,核苷三磷酸脱氢酶(nucleoside triphosphate hydrolase, NTPase)是弓形虫适应宿主细胞内环境获得嘌呤的寄生机制而产生,对弓形虫在寄生、繁殖方面具有重要意义。由于弓形虫属于嘌呤营养缺陷型,无法通过从头途径合成嘌呤碱基,因此,为了生存和繁殖,弓形虫只能通过补救合成途径直接从宿主细胞获取嘌呤。弓形虫NTPase蛋白存在于速殖子体膜表面,但当速殖子侵入宿主细胞不久,NTPase即分泌入纳虫泡的网状管腔系统内,在二巯基化合物(如DTT)的激活作用下,能连续水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸形式。感染宿主细胞的弓形虫速殖子即是利用NTPase分解宿主细胞来源的ATP,以合成维持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。弓形虫NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型。编码NTPase基因组DNA无内含子,由3个连续排列的开放读码框架(ORF)组成,分别为NTP1、NTP2和NTP3。其中NTP2不具备编码蛋白的能力,而NTPase-Ⅰ、NTPase-Ⅱ是分别与编码基因NTP3和NTP1相对应的一组同工酶。其中NTPase-Ⅰ仅存在于有毒株,而NTPase-Ⅱ几乎存在于所有弓形虫虫株。显而易见,以NTPase-Ⅱ蛋白作为药物或疫苗靶点将比NTPase-Ⅰ蛋白具有更广泛地应用前景。本研究将以原核表达的NTPase-Ⅱ蛋白免疫BALB/c小鼠,制备特异性抗弓形虫核苷三磷酸水解酶(NTPase)Ⅱ型重组蛋白(rTgNTPase-Ⅱ)单克隆抗体,观察所获单克隆抗体的保护作用,阐明弓形虫NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生长发育中的作用。同时观察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠体内所产生的免疫反应类型及免疫保护作用,为寻找新的疫苗靶点提供实验依据。1.弓形虫NTPase-Ⅱ的基因克隆和蛋白表达采用PCR方法扩增得到刚地弓形虫RH株NTPase基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,成功构建原核表达载体pBAD-HisB-NTPase,转入E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,表达产物主要存在于包涵体中。融合蛋白的相对分子量(Mr)约70 kDa,与理论值相近。使用Ni离子亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白,SDS-PAGE鉴定纯度约为84%. Western blotting和ELISA分析结果显示,纯化的重组蛋白可被鼠抗重组蛋白血清特异性识别,具有良好的免疫反应性和免疫原性。2.抗弓形虫rNTPase-Ⅱ单克隆抗体的制备及其功能分析通过制备特异性抗弓形虫核苷三磷酸水解酶(NTPase)Ⅱ型重组蛋白(rTgNTPase-Ⅱ)单克隆抗体,观察所获单克隆抗体的保护作用,以此阐明弓形虫NTPase-Ⅱ在RH株速殖子生长发育中的作用。将rTgNTPase-Ⅱ抗原(50μg/100μl)以福氏完全佐剂等体积混合后皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,并以同样剂量的rTgNTPase-Ⅱ抗原等体积混合福氏不完全佐剂后每隔2周进行1次加强免疫,一共进行3次加强免疫。最后一次加强免疫后3天取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞进行细胞融合,细胞融合率为92.71%(534/576)。利用纯化的rTgNTPase-Ⅱ作为包括抗原,以间接ELISA法进行筛选。对于筛选到的阳性克隆株以有限稀释法进行3次亚克隆,最终得到2株高亲和力杂交瘤细胞系,分别命名为MNT1与MNT2。将得到的单克隆抗体注射经降植烷处理的BALB/c小鼠腹腔,收集腹水以亲和层析法进行单抗纯化。2.1单克隆抗体的鉴定：采用Sigma抗体亚型检测试剂盒测定单克隆抗体的免疫球蛋白类别和亚类,证实2株单克隆抗体均为IgG2a亚类。间接ELISA法测定杂交瘤细胞株培养上清与小鼠腹水效价,检测结果表明,MNT1与MNT2细胞培养上清效价分别为1：12 800 and 1：6 400,而小鼠腹水效价分别为1：51200与1：12 800。同时将杂交瘤细胞株连续传代三个月及液氮冻存一个月后复苏,不同时间取其培养液上清,用间接ELISA法检测其抗体效价,测定抗体分泌的稳定性。结果发现,细胞连续传代三个月,分泌抗体的能力稳定。液氮冻存一个月后复苏,对细胞上清进行检测,抗体仍为阳性。以Western Blot法鉴定单克隆抗体的特异性,结果表明,两株单克隆抗体与rTgNTPase-Ⅱ蛋白在约70kDa处出现反应条带,与弓形虫RH株速殖子全虫抗原在约63kDa处出现反应条带,均与预期结果相符。而与阴性对照(含pBAD-HisB载体的DE3细菌裂解液)之间未出现反应条带。最后,将纯化的弓形虫RH株速殖子分别与单克隆抗体或阴性对照反应后,加入FITC标记的羊抗鼠IgG,利用间接荧光抗体实验(IFAT)于激光共聚焦显微镜下观察NTPase-Ⅱ在速殖子中的定位,发现2株单克隆抗体均与弓形虫RH株速殖子出现荧光反应。2.2单克隆抗体保护性实验2.2.1单克隆抗体抑制虫体入侵与胞内生长发育情况：将纯化的弓形虫RH株速殖子与单克隆抗体孵育后按照虫株数：细胞数为2：1的比例,对COS-7宿主细胞进行体外细胞培养。并于感染后3小时、9小时与15小时分别取出不同处理组于油镜下进行计数观察。其中与单抗孵育3h的细胞培养孔中观察100个宿主细胞中被速殖子感染的细胞数量(感染率),评价单抗对弓形虫RH株速殖子入侵宿主细胞的抑制作用。同时分别计数与单抗孵育3h、9h、15h的细胞培养孔中100个感染速殖子的阳性细胞中弓形虫虫体数量(感染度),评价单克隆抗体对弓形虫RH株在宿主细胞内生长发育的抑制作用。感染3小时后的感染率检测结果表明：MNT1、MNT2、IgG2a与完全培养液处理后的感染率分别为12%,10%,12%与13%,各组之间结果无统计学差异(χ2=0.458,P=0.928),表明2株单克隆抗体无抑制弓形虫RH株速殖子入侵COS-7宿主细胞的能力。然而在速殖子感染9h(χ2=19.741,P=0.000)与15h(χ2=44.974,P=0.000)后,各处理组间感染度均存在显著性差异,其中MNT1单克隆抗体处理组抑制虫体在COS-7细胞中增殖的效果最好,MNT2单克隆抗体处理组次之。表明2株单克隆抗体均可显著抑制弓形虫RH株速殖子在宿主细胞内的生长发育。且MNT1单克隆抗体抑制作用更显著。2.2.2单克隆抗体抑制酶活性情况：将纯化的弓形虫RH株速殖子与单克隆抗体孵育后接种于细胞培养板中,以DTT刺激10分钟后加入Triton X-100,对于速殖子裂解液上清进行酶活性检测,观察单抗对酶活性的抑制作用。由于NTPase可水解ATP至ADP,同时释放出无机磷(Pi)。通过检测Pi浓度发现,与对照组相比,MNT1单克隆抗体处理组(P=0.002)与MNT2单克隆抗体处理组Pi浓度均显著降低(P=0.035),表明NTPase酶活性可被2株单克隆抗体显著抑制。2.2.3单克隆抗体被动免疫保护性实验：将30只BALB/c小鼠随机分为6组,分别标记为MNT1-1、MNT1-2、MNT2-1、MNT2-2、IgG2a-1、IgG2a-2。将MNT1-1与MNT1-2两组BALB/c小鼠均以腹腔接种0.2ml(500μg/ml)单克隆抗体MNT1,MNT1-1组于腹腔接种单克隆抗体当天用200个RH株速殖子进入攻击感染,而MNT1-2组于接种48h后以同样数量速殖子攻击感染。MNT2组与IgG2a组根据组名接种不同单抗,其余操作步骤同上。密切观察、记录各组小鼠的死亡时间,评价单克隆抗体的被动免疫保护作用。结果表明,当天攻击感染的不同处理组间,其生存时间存在显著性差异(χ2=14.708,P=0.001),与对照组相比,MNT1单克隆抗体处理组(P=0.004)和MNT2单克隆抗体处理组(P=0.018)小鼠的生存时间均显著延长,而且,MNT1单克隆抗体处理组与MNT2单克隆抗体处理组中小鼠生存时间亦具有显著性差异(P=0.004);同样,48h后攻击感染的不同处理组间的生存时间亦存在显著性差异(χ2=6.531,P=0.038)。然而,尽管MNT1单克隆抗体处理组在48h后攻击感染其生存时间比对照组显著延长(P=0.030),MNT2单克隆抗体处理组与对照组之间无显著性差异(P=0.189),表明应用MNT1被动免疫后产生的免疫保护效果更好,可显著延长小鼠生存时间。本实验为进一步研发新弓形虫疫苗提供了实验依据。3. rTgNTPase-Ⅱ对弓形虫感染的免疫保护及作用机制通过观察rTgNTPase-Ⅱ免疫后,BALB/c小鼠体内所产生的免疫反应类型及免疫保护作用,为寻找新的疫苗靶点提供实验依据。将纯化的rTgNTPase-Ⅱ蛋白进行去内毒素处理,并通过凝胶法检测蛋白样品中内毒素含量,待样品中内毒素含量低于试剂盒最低检测量0.03EU/ml时对SPF级BALB/c小鼠进行免疫。小鼠分为3组：联合免疫组、rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组以及对照组,每组各20只。其中联合免疫组以10μg的rTgNTPase-Ⅱ吸附0.5mg氢氧化铝佐剂进行联合免疫,对照组为PBS混合氢氧化铝佐剂进行免疫。初次免疫后每隔2周进行一次加强免疫,共加强免疫3次。待加强免疫结束后2周,对各免疫组小鼠进行特异性IgG抗体实验、细胞免疫反应实验及免疫保护作用研究。3.1.体液免疫反应评价：以5μg/ml的rTgNTPase-Ⅱ为包被抗原建立间接ELISA法,检测各免疫组小鼠血清中特异性总IgG抗体与IgG1、IgG2a两个抗体亚类。结果显示,联合免疫组中抗rTgNTPase-Ⅱ总IgG抗体比rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.000)和对照组(P=0.000)均显著升高,而rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组与对照组相比亦显著升高(P=0.000)。此外,与对照组相比,联合免疫组小鼠血清中IgGl抗体亚类与IgG2a抗体亚类水平比rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.005,P=0.005)和对照组(P=0.000,P=0.000)均显著升高,而rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组与对照组相比亦显著升高(P=0.000,P=0.000),提示rTgNTPase-Ⅱ所诱导产生的免疫反应可能为Th1/Th2混合型免疫反应。然而,通过计算各rTgNTPase-Ⅱ免疫组中IgG1与IgG2a比值,我们可以发现,rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组中所诱导产生的为Thl型细胞免疫应答(IgG2a/IgG1>1),而联合免疫组中所诱导产生的为Th2型细胞免疫应答(IgG2a/IgG1<1),表明佐剂具有增强体液免疫反应的作用。3.2.细胞免疫反应评价3.2.1淋巴细胞增殖实验：最后一次加强免疫后2周,每组各取5只小鼠脾淋巴细胞,悬浮后按3×105/孔加入96孔细胞培养板,随后以rTgNTPase-Ⅱ(10μg/ml)刺激体外培养的免疫小鼠脾淋巴细胞,待孵育72小时后以CCK-8法检测各孔吸光度,按以下公式计算刺激指数：刺激指数(SI)=刺激孔均值/对照组均值。以ConA作为阳性对照,完全培养液作为阴性对照。与对照组相比,联合免疫组(P=0.000)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.002)中,小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激出现了显著的淋巴细胞增殖反应,但两个免疫组之间差异并无显著性(P=0.295)。3.2.2细胞因子检测：按上述方法得到小鼠脾淋巴细胞后,以5×106/孔铺入24孔细胞培养板,待孵育24小时后检测培养上清中IL2、IL-4浓度,72小时后检测IL-10浓度,96小时后检测IFN-γ浓度。与对照组相比,联合免疫组(P=0.000)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.000)中小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激产生了IFN-γ。同样,联合免疫组(P=0.002)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.013)中小鼠脾淋巴细胞均对rTgNTPase-Ⅱ刺激产生了IL-2。然而却只有联合免疫组的细胞培养上清中IL-10含量与对照组(P=0.021)和rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.031)相比均出现显著升高,而所有免疫组中均未检测出IL-4。3.2.3 T细胞亚群分析：按之前操作步骤分别获取各免疫组5只小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,调整细胞浓度约106/50μ1/管,每管加入3株荧光标记的单克隆抗体：CD4(RM4-5)-FITC Rat Anti-Mouse、CD8a(53-6.7)-PE Rat Anti-Mouse和CD3e-PE-CYTM5 Hamster Anti-Mouse 20μl。暗室孵育后于流式细胞仪上计数10000个细胞,记录CD3+CD4+CD8"和CD3+CD4-CD8+细胞百分数。结果发现,联合免疫组(P=0.000)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.000)中CD3+CD4+双阳性T细胞/CD3+CD8+双阳性T细胞的比值均显著低于对照组。3.3免疫保护作用评价3.3.1急性攻击感染：为观察免疫小鼠对弓形虫急性感染的免疫保护作用,在免疫结束后2周用1000个弓形虫强毒株RH株速殖子于腹腔攻击感染各免疫组小鼠,每组各感染5只,记录各组小鼠生存时间。与对照组相比,联合免疫组(P=0.021)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.020)小鼠生存时间均显著延长。3.3.2慢性攻击感染：为观察各免疫组小鼠对弓形虫慢性感染所产生的免疫保护作用,将各组最后剩下的10只小鼠以弓形虫弱毒株PRU株包囊经口喂食攻击感染,每只小鼠感染20个包囊。攻击感染5周后,计数各免疫组小鼠脑组织中包囊数。结果显示联合免疫组(P=0.008)与rTgNTPase-Ⅱ单独免疫组(P=0.014)脑组织包囊数均显著减少,下降率分别为62.9%和57.6%。从而证实rTgNTPase-Ⅱ可诱导BALB/c小鼠产生特异性免疫反应,该免疫反应以Thl型细胞应答为主。由rTgNTPase-Ⅱ诱导产生的免疫反应可为BALB/c小鼠提供部分的免疫保护作用。