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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是以母猪流产及仔猪呼吸系统障碍为主要病征的传染病,病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)。该病毒传染性强,而且感染机体后致免疫抑制及各种并发症,给养猪业造成巨大危害和经济损失。病毒基因的变异也给防治增加了难度。糖基化囊膜蛋白5(GP5)是PRRSV的主要结构蛋白,具有结合细胞受体及诱导细胞凋亡等功能,而且该蛋白能诱导中和抗体产生,是新型疫苗设计的主要靶蛋白,因此在病毒的生理功能及PRRS的防治上具有重要作用。本研究从山东泰安及周边地区多个猪场取无名高热病猪猪肺组织等通过常规病毒检测和分离方法,经过细胞病变和间接免疫荧光检测证明所分离到的PRRSV是一山东地方流行毒株,命名为SD-4。根据PRRSV美洲经典株VR-2332的ORF5基因设计特异引物,进行RT-PCR和基因克隆ORF5基因,分析其与国内外PRRSV毒株差异,为该病的流行病学调查提供理论依据;同时,利用大肠杆菌在体外表达了GST-tGP5,并对重组蛋白的抗原特性进行研究;针对有些PRRSV疫苗未能对猪机体提供完全保护的情况,本研究还利用400余份猪血清建立了一个间接ELISA体系,来间接反映机体抗PRRSV的抗体水平,为指导当地生产防疫和开发该病的新型疫苗以及评价疫苗免疫效果的试剂盒的研制奠定基础。从2007年底山东无名高热病猪送检样品肺部组织,提取猪肺组织的总RNA并利用RT-PCR技术扩增出编码GP5的ORF5基因。目的DNA片段连接到pMD18-T载体上进行DNA序列测定。结果发现山东分离株SD-4 ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸残基,通过分析ORF5基因序列及与其它毒株的比较,将北美洲株分为Ⅰ亚群和Ⅱ亚群。SD-4的核苷酸与Ⅰ亚群和Ⅱ亚群及欧洲毒株相比同源性分别为87.4%～89.9%、92.7%～99.2%和63.7%～63.8%。其氨基酸序列的同源性相比分别为85.1%～91.0%、90.5%～99.5%和56.7%～57.7%。进化树分析结果表明SD-4与高致病性毒株JXA1,HUB1, HEB1和SY0608的亲缘关系很近。同时设计引物从重组质粒pMD18-T-ORF5中扩增出缺失了N端26个氨基酸残基的tGP5编码序列tORF5,目的基因亚克隆构建成重组表达质粒pGEX-6p-tORF5,转化大肠杆菌后诱导表达。表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot分析,证实为tGP5与谷胱甘肽转移酶(Glutathlone S-trans ferase ,GST)的融合表达蛋白,分子量为40kDa,表达量占菌体总蛋白的20%左右,主要以包涵体形式存在。经过切胶纯化和电洗脱后的GST-tGP5蛋白纯度可达95%以上,并能与PRRSV阳性猪血清产生特异性反应,而标签蛋白GST不与该血清反应。将纯化后的表达蛋白包被ELISA板后对标准阴/阳性血清进行检测,结果在抗原包被浓度为100 ng/孔,血清稀释度为400倍稀释的条件下P/N值最大。用此试验条件对62份PRRSV阴性血清进行ELISA检测后推导出以S/P值0.4作为阳性血清判定的临界点。S/P值大于0.4的血清判断为阳性血清,反之小于0.4的为可疑或阴性。此检测体系的结果与病毒中和实验的结果一致性达94.12%。以纯化后的融合蛋白作为抗原免疫小鼠,制备出的抗GST-tGP5融合蛋白血清经间接ELISA和间接免疫荧光鉴定,得到跟GST-tGP5特异性反应的多克隆抗血清,其滴度为1/20000以上。但该抗血清是否能在体外甚至体内试验中对病毒的感染起中和作用还有待进一步研究。