目的:TopⅡβ与神经细胞的发育、分化有关。本研究通过观察胚胎时期、出生后的幼鼠及腹腔给予TopoⅡ抑制剂后,脑组织内nestin、GFAP、β-mbulinⅢ和TopoⅡβ的表达情况,探讨神经干细胞向神经元及神经胶质细胞分化时,TopoⅡβ所发挥的作用。　　 方法:选择由河北医科大学实验动物中心提供健康成年昆明鼠,雌鼠30只,雄鼠15只,12周龄,清洁级。分别取成年昆明鼠,雌鼠2只,雄鼠1只,于晚上20点合笼。次日上午8点前,取雌鼠观察是否有阴道栓,有阴道栓者记为E0d,幼鼠出生当天记为P1d。　　 1、正常组动物标本制备　　 取E18d孕鼠、P1d、P7d、P14d、P28d幼鼠,剥离脑组织,浸泡于4％多聚甲醛溶液进行固定,4℃保存。　　 2、实验组动物标本制备　　 取E18d孕鼠2只,P28d幼鼠4只,按4mg/kg注射依托泊苷注射液,分别于注射后12小时,24小时,按常规取出胎鼠、幼鼠,剥离脑组织,浸泡于4%多聚甲醛溶液进行固定,4℃保存。　　 3、光镜标本制备:常规石蜡包埋,连续性石蜡切片,片厚5μm。常规艇染色、甲苯胺蓝染色,免疫组化(nestin、GFAP、β-tubulinⅢ和TopoⅡβ)染色,DAB显色,免疫双标,脱水、透明、封片。显微镜观察、照相。　　 4、统计学处理:阳性细胞采用专业图像分析软件Image-Pro Plus6.0测定平均光密度值。用ssps13.0软件进行分析,所得数据用均数加减标准差(-x±s)表示。采用SNK-q检验,进行两两比较,以P＜0.05为有显著性差异。　　 结果:　　 1、HE染色的结果观察:　　 E18d,小鼠大脑皮质的六层结构已基本形成。而SVZ区和海马形态上还在发生变化。E18d时,小鼠的SVZ区已经初步形成,细胞呈多层排列,外侧部明显厚于内侧部,细胞形态呈立方形,细胞核圆形或椭圆形。以后SVZ区的变化主要是细胞层次逐渐减少。至P28d,仅SVZ区外上角仍为多层。E18d,可见海马原基是由皮质向深层卷曲形成。随着脑组织的发育,海马结构形成了阿蒙角与齿状回等结构,逐渐与大脑皮质分离,中间隔以胼胝体,至P28d,海马形态基本形成,形成最终的三层细胞结构。　　 2、甲苯胺蓝尼氏染色　　 所观察到的结果与HE染色一致。　　 3、免疫组织化学观察　　 3.1 TopoⅡβ免疫阳性细胞:正常组E18d阳性细胞主要分布在大脑皮质,细胞体积较小,分布集中,其平均光密度值为0.3347±0.0874,SVZ区和海马仅可见散在的阳性细胞分布。P1d-P28d,TopoⅡβ免疫阳性细胞还是主要分布于大脑皮质,但总的趋势是数量减少。P1d的平均光密度值为0.2836±0.0626,P7d的平均光密度值为0.2518±0.0308,P14d的平均光密度值为0.2264±0.0299,P28d的平均光密度值为0.1848±0.0201。SVZ区内阳性细胞变化不明显,在P7d-P28d海马内的阳性细胞明显增多,阿蒙角和齿状回内均可见大量TopoⅡβ阳性细胞。各组之间比较结果显示有显著性差异(P＜0.05)。　　 实验组:注射依托泊苷注射液组,TopoⅡβ免疫阳性细胞的分布与正常组的分布一致,E18d注射依托泊苷注射液12小时组,平均光密度值为0.3051±0.0561,注射依托泊苷注射液24小时组,平均光密度值为0.3048±0.0462,实验组TopoⅡβ免疫阳性细胞减少,与正常组比较结果显示有显著性差异(P＜0.05)。P28d注射依托泊苷注射液12小时组,平均光密度值为0.1821±0.0375,注射依托泊苷注射液24小时组,平均光密度值为0.1801±0.0261。P28d实验组与正常组TopoⅡβ免疫阳性细胞变化不明显,比较结果显示没有显著性差异(P＞0.05)。　　 3.2 nestin免疫阳性细胞:正常组,E18d阳性细胞主要分布在大脑皮质,SVZ区可见散在的阳性细胞分布。P1d-P7d,免疫阳性细胞还是主要分布于大脑皮质,但总的趋势是数量逐渐减少,P14d-P28d在大脑皮质只可见一些散在的阳性细胞分布。实验组,E18d注射依托泊苷注射液12、24小时组阳性细胞均明显增多。P28d注射依托泊苷注射液12、24小时组与正常组没有明显区别。　　 3.3 GFAP免疫阳性细胞:正常组E18d未见阳性细胞,P1d,免疫阳性细胞主要分布于脑膜,P7d-P28d除脑膜外,大脑皮质也可见阳性细胞,在吻侧迁移流(Rostral migratory stream,RMS),出现了明显的阳性细胞。实验组,E18d注射依托泊苷注射液12、24小时组均出现了阳性细胞,均分布于大脑皮质以及RMS。P28d注射依托泊苷注射液12、24小时组大脑皮质以及RMS可见阳性细胞,与正常组没有明显区别。　　 3.4β-tubulinⅢ免疫阳性细胞:正常组各个时期均可见阳性细胞,主要分布于大脑皮质和RMS。SVZ区和海马内未见阳性细胞。实验组,E18d注射依托泊苷注射液12、24小时组均可见阳性细胞,分布于大脑皮质和RaMS,但数量较正常组减少。P28d注射依托泊苷注射液12、24小时组大脑皮质和RMS可见阳性细胞,与正常组数量变化不大。　　 4、免疫荧光双标结果的观察　　 (1)nestin与TopoⅡβ双标:nestin阳性结果和TopoⅡβ阳性结果与免疫组化结果一致。双标显示,大脑皮质大部分细胞可见nestin与TopoⅡβ共同表达于同一细胞内。　　 (2)GFAP与TopoⅡβ双标:GFAP阳性结果和TopoⅡβ阳性结果的分布与免疫组化结果一致。双标显示,只有少数细胞可见GFAP与TopoⅡβ共同表达于同一细胞内。　　 (3)β-tubulinⅢ与TopoⅡβ双标:β-tubulinⅢ阳性结果和TopoⅡβ阳性结果的分布与免疫组化结果一致。双标显示,大脑皮质几乎全部细胞可见β-tubulinⅢ与TopoⅡβ共同表达于同一细胞内。　　 结论:　　 1、观察到小鼠不同时期,大脑皮质、海马、SVZ区的形态发育及细胞构筑的变化。　　 2、TopoⅡβ在小鼠大脑皮质内的表达,在E18d表达最高,随小鼠的神经发育的变慢逐渐减少。提示TopoⅡβ可能参与了神经干细胞向神经元的定向分化。注射依托泊苷的小鼠,TopoⅡβ的表达降低,β-tubulinⅢ也降低,GFAP变化不明显,进一步证实TopoⅡβ参与了神经干细胞向神经元的定向分化。　　 3、正常组nestin的变化与TopoⅡβ一致,提示它也可能参与了神经干细胞向神经元的定向分化。但是注射依托泊苷后,E18d小鼠脑中nestin表达反而高于正常组,P28d变化不明显,提示nestin只在神经干细胞向神经元分化过程中一过性表达,不一定起决定性作用。