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目的1.研究干扰素刺激核酸外切酶基因20kDa(Interferon-stimulated exonuclease gene 20,ISG20)在类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞(Rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLS)中的生物学功能;2.研究ISG20在RA FLS中异常表达的调控机制;3.研究ISG20调控RA FLS生物学活性的分子机制。方法设计并合成靶向ISG20的小干扰(small interfering RNA,siRNA),转染RA FLS细胞后沉默ISG20的表达,阴性对照组(negative siRNA,NC),检测干扰效率并筛选出干扰效率最佳的siRNA序列,用于后续实验;构建过表达ISG20的重组腺病毒载体上调RA FLS中ISG20的表达,采用RT-qPCR和Western blot确认ISG20的表达;MTS法检测ISG20对RA FLS细胞增殖能力的影响;体外管腔形成实验检测RA FLS中ISG20表达水平对人脐静脉血管内皮细胞CRL-1730细胞血管形成能力的影响;流式细胞术检测ISG20对RA FLS细胞周期的影响;RT-qPCR检测ISG20对RA发病过程中关键的炎性因子IL-6的影响;Transwell检测ISG20对细胞迁移和侵袭能力的影响;RT-qPCR检测ISG20对PBMC细胞中与Th17细胞分化相关基因表达的影响;RT-qPCR检测ISG20对破骨分化相关基因表达的影响。RT-qPCR和Western blot研究炎性因子IL-6、LPS和TNF-ɑ对ISG20的影响,以及与ERK、NF-κB和STAT3信号通路相应的抑制剂PD98059、PDTC和stattic共同作用对ISG20表达的影响;RT-qPCR和Western blot检测TLR4信号通路抑制剂CLI-095对LPS刺激的ISG20表达的影响。转录组测序筛选ISG20下游调控的RA关键基因及通路;RT-qPCR法验证ISG20对PTEN和PPARɑ的表达影响及这两种基因对IL-6表达调控;结合查阅文献及生物信息学预测,筛选到对IL-6具有负调控功能的miR-365和miR-146,RT-qPCR检测ISG20对两种miRNA的调控,对mRNA降解速率的影响。并验证其对IL-6的调控作用。结果1.ISG20基因在RA FLS中生物学功能RT-qPCR结果显示:特异性靶向ISG20的siRNA(200μmol/L)转染RA FLS 24 h可以显著抑制ISG20的表达(vs NC,P<0.01);RT-qPCR和Western blot检测证实重组腺病毒载体(0.8μg/mL)可明显上调ISG20的表达(vs control,P<0.01);MTS结果显示,与NC相比,沉默ISG20可明显抑制细胞增殖速率(P<0.05);体外管腔形成实验显示,沉默RA FLS中ISG20后,其培养基可明显抑制CRL-1730管腔形成(P<0.01)而高表达ISG20对CRL-1730管腔形成的数量具有促进作用(P<0.01);流式细胞检测结果显示,沉默ISG20表达可使G0/G1期(P<0.01)细胞比例升高,而S期(P<0.01)和G2/M期(P<0.001)细胞比例降低;RT-qPCR结果显示,沉默ISG20可以显著抑制IL-6的表达(P<0.05),同时,高表达ISG20可以显著升高IL-6的表达(P<0.05);沉默RA FLS中ISG20的表达,可以明显下调共培养体系PBMC细胞中与Th17细胞分化相关的RORc、IL-17、IL-22和IL-23 mRNA的表达(P<0.05),同时,高表达ISG20可以上调上述四种mRNA及IL-21的表达(P<0.05);RT-qPCR显示沉默ISG20可以明显下调RA FLS中破骨相关因子RANK和RANKL的表达(P<0.05),而高表达ISG20可以显著上调RA FLS中RANK和RANKL的表达(P<0.05);Transwell结果显示ISG20对基础状态下RA FLS的迁移和侵袭能力没有明显调控作用。2.ISG20在RA FLS中异常表达的调控机制炎性因子IL-6(10 ng/mL),LPS(10 ng/mL)和TNF-ɑ(10 ng/mL)均可上调ISG20的表达(IL-6,P<0.01;LPS,P<0.01;TNF-ɑ,P<0.05),其中LPS对ISG20的上调作用最明显。TLR4、ERK、NF-κB和STAT3信号通路抑制剂可抑制LPS对ISG20的上调作用。其中以TLR4和ERK信号通路抑制剂对LPS上调ISG20的阻断作用最明显(P<0.05)。3.ISG20调控RA FLS生物学活性的分子机制转录组测序结果显示ISG20可以调控RA FLS中多种关键基因和信号通路的表达;RT-qPCR显示沉默ISG20对PTEN和PPARɑ基因表达具有抑制作用;沉默PTEN和PPARɑ基因可促进IL-6表达;沉默RA FLS中ISG20可以抑制miR-365和miR-146的表达;miR-365和miR-146对IL-6存在负调控作用。沉默ISG20可以使PTEN和PPARαmRNA的降解速度减缓,mRNA的半衰期延长。结论1.ISG20在RA FLS中具有促进细胞增殖、炎性因子IL-6的分泌和CRL-1730血管生成的作用;沉默ISG20可将细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制细胞增殖;此外ISG20还可能参与Th17细胞分化和破骨分化;ISG20对基础状态下RA FLS的迁移和侵袭能力没有影响;提示ISG20在RA中发挥重要作用。2.炎性因子IL-6、LPS和TNF-ɑ可刺激RA FLS中ISG20的表达升高,其中LPS的上调作用最为明显;阻断ERK和TLR4信号通路可明显逆转LPS对ISG20的上调作用。3.转录组测序和生物信息学分析揭示ISG20可通过下调PTEN、PPARɑ及miR-365和miR-146的表达从而促进IL-6的表达;ISG20可能通过调控上述基因或miRNA的表达间接影响IL-6的表达。