研究背景和目的：前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一,致死率排在第二位。随着人类社会经济的发展及寿命的延长,前列腺癌的发病率一直处于连续上升中。前列腺癌的发生、进展及预后是多基因参与和多步骤的过程,包括前列腺上皮细胞的基因损伤和上皮-间质相互作用的改变。血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen, PSA)是目前最常用的诊断前列腺癌的分子生物学标记物。PSA筛选能早期发现前列腺癌并使大量早期前列腺癌得到根治。然而,PSA虽然有很好的敏感性,但其特异性差,存在诊断灰区,前列腺炎、前列腺增生症、急性尿潴留等均可导致PSA升高,加上前列腺癌发病缓慢而且隐匿,所以不能单凭PSA判断前列腺癌的形成及预后。每个前列腺癌患者对雄激素阻断治疗(Androgen deprivation therapy, ADT)治疗的敏感程度都不一样,虽然ADT能极大的降低血清PSA水平、延缓前列腺癌进展,但几乎所有患者在经过14-30月的ADT后产生雄激素抵抗,使其从雄激素依赖型前列腺癌(Androgen dependent prostate cancer)发展成为雄激素非依赖型前列腺癌(Androgen independent prostate cancer, AIPC)或激素抵抗型前列腺癌(Hormone-resistant prostate cancer, HRPC),导致前列腺癌复发。一旦发展成为AIPC或HRPC,大多数患者在18个月后死亡。所以,很有必要能找到诊断前列腺癌的特异性辅助指标,并且这个指标能在确诊前列腺癌后判断前列腺癌是否复发。近年来,SOX家族基因(SOX genes, SOXs)在肿瘤的诊断及治疗中的作用越来越受到人们的关注。SOXs属于高迁移率组(High Mobility Group,HMG)超家族,能编码转录因子。目前发现的SOXs有20多个,它们与细胞分化与增殖相关,如性别决定、软骨形成、神经系统发育等。根据在HMG盒的位置不同,SOXs可分为A到H组,在同一组的基因有相近的功能,不同组的基因功能亦能相互联系,就是同一基因在同一细胞不同的发育过程的功能也不尽相同。SOXs可以作为癌基因,直接证据是SOX3的异位表达可以引起鸡胚纤维母细胞的癌变,且该效应同时受HMG域及转录激活区的调控；SOXs亦可以肿瘤抗原,例如在伴或不伴重症肌无力综合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)的小细胞肺癌患者中,常能检测到SOX1抗体,并能作为肿瘤检测的血清学指标,SOX10在肿瘤免疫治疗反应良好的黑色素瘤患者也被鉴定为相关的肿瘤抗原。由于组织的不同,SOXs中同一基因在不同肿瘤中的表现也不同,有研究发现SOX7在胰腺癌、胃癌、及食管癌细胞中是上调表达的,但在原发性结直肠癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、前列腺癌中是显著下调的。随着SOXs研究的深入,SOXs与前列腺癌的相关关系成为研究的一个热点。Guo等人专门研究了SOX7蛋白在前列腺癌中的表达情况,发现SOX7在47%的前列腺癌中下调表达,SOX7mRNA在60%的前列腺癌中下调表达,这可能是由于肿瘤特异性启动子高度甲基化的结果。SOX7蛋白与连环蛋白相关,它可能通过减少连环蛋白的激活来抑制连环蛋白介导的转录过程,提示SOX7可能是前列腺细胞独立的检查点。SOX9是SOX家族基因中研究较多、较透彻的基因。Drivdahl等人在M12/mac25细胞系中检测到SOX9基因水平的上调导致细胞分化率下降、细胞周期在G0/G1期停止以及凋亡敏感性的上升；Thomsen等人发现SOX9在小鼠前列腺发育的初级阶段中表达,SOX9基因敲除导致腹侧前列腺发育障碍以及前列腺的畸形分化,证实SOX9是前列腺芽上皮早期分化的必需基因；Wang等人证实SOX9在原发性前列腺癌中表达,在生化复发性前列腺癌及前列腺癌细胞系中通常有更高的表达,SOX9在前列腺癌中接受Wnt/beta-catenin通路的调节,基底细胞中的SOX9起到促进前列腺发育和维持前列腺上皮细胞的作用,继而他们又发现SOX9在前列腺癌细胞系中促进肿瘤细胞的分化,表明它可能与前列腺癌侵袭生长相关。关于SOX10与前列腺癌的研究极少。文献报道它主要与人类黑色素瘤相关。钟惟德教授等人的研究发现SOX10在前列腺癌组织中是呈低表达的,它与SOX7是正相关关系,与SOX9是负相关关系。有证据表明,雄激素水平是前列腺癌复发的关键因素,即使雄激素水平在去势水平,雄激素受体(AR)的激活作用也会一直持续。在雄激素阻断治疗后,AR的高表达会缩短去势后PSA升高的时间。而在雄激素抵抗并发生前列腺癌转移的患者中,AR核染阳性的患者的死亡率显著增加。Wang等人的研究表明高水平的外源性SOX9降低AR的表达和活性,相反,低水平的外源性SOX9促进AR的表达和活性,在前列腺癌中SOX9调节AR的表达。SOX10低表达可能引起ErbB3的表达降低,而抑制ErbB3能增加雄激素阻断治疗后的前列腺癌细胞对雄激素的敏感性。SOX10可能通过抑制ErbB3的表达来促进AR的活性,最终增强前列腺癌细胞对雄激素的敏感性。为了进一步研究SOXs在诊断前列腺癌和判断是否复发上的作用,我们利用前期的基因芯片筛选及国外公共数据库查询,选择SOX7、SOX9、SOX10基因作为研究对象,以RT-QPCR技术检测它们在前列腺癌细胞株DU145、LNCap、PC3和正常前列腺细胞株RWPE-1中的表达量,免疫组化技术检测它们在前列腺癌组织和癌旁组织的表达,并结合SOX7、SOX9、SOX10免疫组化评分与前列腺癌患者临床病理参数进行分析。材料：收集2001年至2011年广州市第一人民医院泌尿外科前列腺根治手术摘除或者经尿道前列腺电切术切下前列腺癌组织标本147例,其中19例前列腺癌患者已确定发生局部或远处转移,前列腺增生组织28例。所有患者在取材前未行手术去势或药物去势、未行药物化疗或放射治疗,取材前1周未行前列腺直肠指诊、发生急性尿潴留,无前列腺炎症病史。液氮速冻收集保存。以上标本均经过病理诊断证实。前列腺癌细胞系PC3、DU145、LNCap和永生化的前列腺细胞系RWPE-1均为广州市第一人民医院中心实验室所保存。细胞生长状态良好时用于实验。方法：利用基因芯片进行初步筛选,选择在前列腺癌组织和前列腺增生组织中有差异表达的SOX7、SOX9、SOX10, Oncomine数据库中查询它们的表达情况。RT-QPCR检测前列腺癌细胞株PC3、DU145、LNCap和永生化的前列腺细胞株RWPE-1中SOX7、SOX9、SOX10的表达。用Trizol提取细胞株RNA后进行反转录,反转录按照TAKARA试剂盒说明书操作。用上述基因的引物在荧光定量PCR仪上进行反应。反应参数为：95℃,5分钟；接着95℃10秒,60℃20秒,72℃20秒,一共进行40次循环。反应完成后用IQ5软件输出,每个样本SOX7、SOX9、SOX10表达值由β-actin表达值进行标准化,用比较CT值法分析表达差异。所有组织标本均用10%中性甲醛溶液固定,石蜡包埋,切割成厚4um的切片。采用过氧化氢标记的链霉素抗生物素蛋白-过氧化氢酶法(SP法)进行免疫组化染色。根据肿瘤细胞核的阳性比例及染色强度,采用二次记分法评判,用PBS代替一抗作为阴性对照。根据免疫组化评分将小于4分的归为低表达组(阴性),而大于或等于4分则归为高表达组(阳性)。免疫组化评分由两位病理学家完成。统计学处理：所有实验数据均用X±s表示,数据统计用SPSS13.0统计软件包处理,one-way ANOVA检验分析细胞株中SOX7、SOX9、SOX10的表达情况,两两比较采用Bonferroni法,Pearsonχ2检验分析它们在前列腺癌与前列腺增生组织中的免疫组化染色情况,Pearson相关性检验分析它们之间的相关关系,两独立样本t检验分析它们在前列腺癌组织中的免疫组化评分与前列腺癌患者临床病理参数之间的关系,Kaplan-Meier检验进行总体生存率、无转移生存率和无生化复发生存率分析,Cox回归进行多因素分析SOX7、SOX9、SOX10不同表达对无生化复发生存率的影响程度。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.我们的基因芯片筛选表明,相对于前列腺增生组织,SOX7(P=0.001)和SOX10(P=0.010)在前列腺癌组织中是下调表达的,而SOX9(P=0.029)在前列腺癌中则是上调表达的。2.通过oncomine公共数据库查询SOX7、SOX9、SOX10在前列腺癌组织及非癌组织中的表达情况,发现SOX7、SOX10在前列腺癌组织中是低表达的,而SOX9在前列腺癌组织中是呈高表达的。3.我们通过RT-QPCR技术检测SOX7、SOX9、SOX10在前列腺癌细胞株PC3、DU145、LNCap和永生化前列腺细胞株RWPE-1中的表达,发现SOX9在PC3细胞株中表达显著高于RWPE-1细胞株(P=0.026),SOX10在PC3细胞株中表达显著低于RWPE-1细胞株(P=0.001),而在LNCap细胞株中的表达是显著高于RWPE-1细胞株的(P=0.001),未发现SOX7在以上细胞系中有差异表达。4. SOX7、SOX9染色主要位于细胞核,而SOX10则主要位于细胞胞浆。相对于前列腺增生组织,SOX7(χ2=5.041,P=0.025)和SOX10(χ2=6.703,P=0.010)在前列腺癌组织中是低表达的,SOX9(χ2=4.105, P=0.043)是高表达的。5.在前列腺癌组织中,SOX7的表达与SOX9的表达呈负相关(r=-0.263,P=0.001),与SOX10的表达呈正相关(r=0.422,P=0.000),而SOX9的表达与SOX10的表达呈负相关(r=-0.377,P=0.000)。6.采用二次计分法计算SOX7、SOX9、SOX10在前列腺癌组织的染色评分,将此评分与相应前列腺癌患者的临床病理参数结合分析,发现SOX7在血清PSA水平小于10ng/ml(t=-1.994,P=0.048)、Gleason score小于7分(t=-2.034,P=0.047)、肿瘤TNM分期小于T2A(t=4.245,P<0.001)和病理分期T2A-T2C(t=3.224,P=0.002)前列腺癌患者中有较高的表达,比较有显著的统计学意义；SOX9在Gleason score大于或等于7分(t=3.393,P=0.001)和肿瘤TNM分期大于T2A(t=-2.871,P=0.005)的前列腺癌患者中有较高的表达,比较有显著的统计学意义；而SOX10在Gleason score小于7分(t=-2.902,P=0.006)的前列腺癌患者中有较高表达,而在肿瘤TNM分期大于或等于T2A(t=3.365,P=0.001)的前列腺癌患者中的表达则较低,比较有显著的统计学意义。SOX7在前列腺癌中的表达与恶性程度负相关,SOX9在前列腺癌中的表达与恶性程度正相关,暂时无法判断SOX10在前列腺癌中的表达与恶性程度的确切关系。7.将染色评分大于或等于4分(阳性)和小于4分(阴性)的前列腺癌组织分别划分为高表达组和低表达组,利用Kaplan-Meier检验进行总体生存率、无生化复发生存率及无转移生存率分析,发现SOX7表达与患者总体生存率及无转移生存率无显著差异,而SOX7高表达患者相对于SOX7低表达患者有较好的无生化复发生存率(Log Rank=10.790,P=0.001);SOX9高表达患者相对于SOX9低表达患者有较好的总体生存率(Log Rank=7.224,P=0.007)、无转移生存率(Log Rank=10.912,P=0.001)和无生化复发生存率(LogRank=4.301,P=0.038)。SOX10表达与患者总体生存率、无生化复发生存率及无转移生存率均未见显著差异。8.按上述方法划分为高表达组和低表达组,COX回归进行多因素分析,发现SOX7(RR=0.300,P=0.003)与SOX9(RR=0.121,P<0.001)是前列腺癌无生化复发生存率的保护因子,SOX7和SOX9高表达的前列腺癌患者分别相对于SOX7和SOX9低表达的前列腺癌患者有较好的无生化复发生存率。结论：1.经过基因芯片筛选出前列腺癌和前列腺增生组织中特异性表达的SOXs及随后的免疫组化验证,表明SOX7、SOX10可能是抑癌基因,SOX9可能是促癌基因,可通过检测SOX7、SOX9、SOX10水平鉴别前列腺癌和前列腺增生。2. SOX7/SOX9、SOX9/SOX10可能是诊断前列腺癌的基因组合,通过检测这两对基因组合的水平或许可提高早期诊断前列腺癌效率。3.结合SOX7、SOX9、SOX10在前列腺癌组织中的免疫组化评分与相应前列腺癌患者的临床病理参数进行分析,发现体内SOX7、SOX9的失调与高级别前列腺癌相关,表明可以通过检测它们在体内的水平可判断前列腺癌的恶性程度。4.结合SOX7和SOX9在前列腺癌中的相互关系,我们建立了前列腺癌中SOX7和SOX9双向调节机制,为进一步研究前列腺癌发生、发展机制打下基础。5.在生化复发生存率方面,SOX7和SOX9与无生化复发生存率显著相关,随后的多因素分析发现SOX7与SOX9是前列腺癌无生化复发生存率的保护因子,SOX7和SOX9高表达的前列腺癌患者分别相对于SOX7和SOX9低表达的前列腺癌患者有较好的无生化复发生存率。可通过检测已确诊为前列腺癌患者的SOX7、SOX9水平预测其是否存在早期生化复发风险及初步判断前列腺癌的预后。6.高水平的SOX7、SOX9可能是通过抑制前列腺癌中AR的表达从而抑制前列腺癌生化复发。其中,SOX9在前列腺癌发展中扮演双重角色,既是促癌基因,又是抑癌因子。