【摘 要】
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甘氨酸裂解系统(GCS)在一碳(C1)代谢中起着关键作用，并且涉及生物医学和生物技术领域中到许多重要代谢物的生物合成。尽管科研人员对甘氨酸裂解体系所涉及的蛋白质(H、T、P和L)以及该复合酶系的反应机制进行了广泛的研究，但该体系定量检测方法的缺乏限制了该领域的深入研究。本课题首先开发了一种使用HPLC来直接定量检测和分析甘氨酸裂解系统内穿梭蛋白--H蛋白的未脂化形式(Hapo)和脂化形式(Hlip)的方法。Hlip对H蛋白功能的行使起着至关重要的作用，并决定着GCS的代谢活性。本课题通过研究温度、硫辛酸、
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甘氨酸裂解系统(GCS)在一碳(C1)代谢中起着关键作用，并且涉及生物医学和生物技术领域中到许多重要代谢物的生物合成。尽管科研人员对甘氨酸裂解体系所涉及的蛋白质(H、T、P和L)以及该复合酶系的反应机制进行了广泛的研究，但该体系定量检测方法的缺乏限制了该领域的深入研究。本课题首先开发了一种使用HPLC来直接定量检测和分析甘氨酸裂解系统内穿梭蛋白--H蛋白的未脂化形式(Hapo)和脂化形式(Hlip)的方法。Hlip对H蛋白功能的行使起着至关重要的作用，并决定着GCS的代谢活性。本课题通过研究温度、硫辛酸、Hapo浓度以及H蛋白的表达等对其脂化的影响，发现即使在最优条件下(外源添加硫辛酸浓度在10-20μM，诱导表达温度为30℃)，Hlip的含量在总H蛋白表达中的比例仅占20-30％。此外，实验中发现Hapo的存在似乎抑制了GCS的整体活性。因此，本课题提出了一种硫辛酸-蛋白质连接酶A(LplA)共表达的策略来提高H蛋白的脂化效率和GCS代谢活性。共表达LplA后，在相同的条件下Hlip的所占比例增加，例如，硫辛酸的添加浓度为20μM时，Hlip的所占比例从30％提高到90％，GCS的代谢活性是未共表达时的2.5倍。这项工作为更好地理解和重新构建GCS系统奠定了定量检测基础。
与此同时，本课题对多功能硫辛酸-蛋白连接酶A(LplA)催化H蛋白脂化的两步级联反应进行了定量和差异性研究，并发现了该级联反应中特异的动力学表现:(1)第一步的反应的速率比第二反应的速率快两个数量级，导致中间产物Lip-AMP的过量积累;(2)Lip-AMP会发生水解反应;(3)H蛋白的脂化作用及其中间产物Lip-AMP的水解反应被各类H蛋白(Hapo、Hlip、HK64A)所增强。基于此，本课题提出了一个新的概念机制模型，并且推测LplA与H蛋白相互作用时的构象变化以及竞争性亲核攻击在该现象中起着关键作用。
此外，在对LplA进行研究的过程中，本课题还首次发现一种由单一具有催化活力的蛋白质形成的智能性水凝胶，它具有响应温度范围窄，响应时间短等优点。
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