前言:　　 目前脂毒性被认为是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)的主要发病机制之一。生理条件下，一定的糖和脂对于胰岛功能的维持是必不可少的。但是，慢性持续性的处在高脂环境中却可引发胰岛β细胞胰岛素基因表达受损，胰岛素合成、分泌减少及细胞凋亡。而β细胞凋亡异常增多则是导致β细胞数目减少的重要原因之一。因此从保护胰岛β细胞的角度看，维持胰腺组织中残存β细胞的功能及数量，对阻止糖尿病的进展至关重要。鉴于β细胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理机制中的重要地位和作用，开展相关药物有关对抗脂毒性损伤作用的研究便具有重要意义。　　 胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1，GLP-1)是一种生理性肽类激素，主要由回肠末端、结肠和直肠中的神经内分泌细胞L细胞分泌。无论在动物还是在糖尿病患者体内，GLP-1均可通过和β细胞上的GLP-1受体结合，增强葡萄糖依赖的胰岛素分泌。此外，近年来研究发现，GLP-1还具有其他一些重要的生物学功能，包括调控胰岛β细胞特异性基因表达，促进其分化增殖及再生，抑制凋亡，有效的保护胰岛β细胞的数量及功能等。而无论是1型还是2型糖尿病，胰岛β细胞数量和功能都对其临床进程起着重要作用，故GLP-1及其类似物被认为是糖尿病治疗具有前景的重要物质之一。Exendin-4是GLP-1受体的长效激动剂，能发挥与GLP-1相近的血糖调节作用，并具有相似的抗细胞凋亡、促胰岛细胞增殖作用。而对于T2DM的主要机制之一，脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡，Exendin-4能否发挥其保护作用，改善β细胞数量及功能，目前报道尚少，因此本研究的目的主要是探讨Exendin-4能否保护胰岛β细胞拮抗脂毒性的毒副作用以及对相关机制的探索。　　 本实验共分如下三部分进行:　　 第一部分:采用体外培养的小鼠胰腺β细胞株MIN6细胞，用游离脂肪酸(Freefatty acid，FFA)（棕榈酸）处理，探讨脂毒性对胰岛β细胞在形态结构、生长、凋亡等方面的影响。　　 第二部分:应用FFA（棕榈酸）建立体外的脂毒性环境，然后用GLP-1受体激动剂Exendin-4处理，探讨Exendin-4对胰岛β细胞株生长、凋亡的影响。　　 第三部分:探讨Exendin-4拮抗脂毒性凋亡的相关机制。　　 第一部分游离脂肪酸诱导小鼠胰岛β细胞凋亡的研究　　 前言:　　 T2DM中常伴有脂质代谢紊乱，高FFA血症是肥胖相关的T2DM代谢紊乱的特征之一。长期处于高FFA环境中可使周围组织对胰岛素的敏感性降低，并使胰岛β细胞功能受损，使胰岛素合成与分泌减少，最终导致胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍。另外FFA长期升高对胰岛β细胞的毒性作用可诱导胰岛β细胞凋亡及坏死，使细胞数目减少。动物实验和人体研究均发现，胰岛β细胞凋亡增加可能是T2DM胰岛β细胞分泌胰岛素功能不足的主要原因。因此高FFA诱导的胰岛β细胞凋亡作用应受到重视。　　 本研究以小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞作为研究对象，选用体内FFA含量比例较高的棕榈酸为代表建立脂环境，探索脂毒性对胰岛β细胞在形态结构、生长、凋亡等方面的影响。　　 实验方法:　　 以小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞作为研究对象，通过不同浓度棕榈酸诱导刺激，探索脂毒性对胰岛β细胞的损伤作用。CCK8检测不同浓度棕榈酸(0.1-0.5mM)作用不同时间(24h、48h)对MIN6细胞活性的影响，Hoechst33258荧光染色法、Annexin V-PI双染流式细胞术、TUNEL法检测不同浓度棕榈酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后细胞的凋亡率，酶联法检测不同浓度棕榈酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后细胞Caspase-3酶活性，电镜观察细胞凋亡的微观结构。　　 结果:　　 1、不同浓度棕榈酸作用MIN6细胞24h及48h，可明显抑制MIN6细胞的生长，并呈一定的时效和量效关系。　　 2、随着棕榈酸浓度的逐渐升高，其诱导MIN6细胞凋亡和促进Caspase-3活性升高的作用逐渐增强。　　 3、电镜观察棕榈酸的毒性使胰岛β细胞形态严重受损，核皱缩，染色质凝聚，胞浆中的分泌颗粒减少或消失。　　 结论:　　 棕榈酸可抑制胰岛β细胞MIN6的细胞活性，并呈一定的时效和量效关系。其产生的脂毒性浓度依赖性的诱导了MIN6细胞凋亡，升高了MIN6细胞的Caspase-3活性，并可引起细胞微观结构的改变。　　 第二部分Exendin-4对棕榈酸诱导的小鼠胰岛β细胞凋亡的影响　　 前言:　　 GLP-1主要在小肠组织中表达，由30多个氨基酸残基组成，是肠促胰素的主要成分。GLP-1可以迅速降低空腹及餐后血糖水平，具有葡萄糖依赖性的促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素生成释放，延迟胃排空、抑制食欲等生理功能。此外，近年来研究发现，GLP-1还具有其他一些重要的生物学功能，它可调控胰岛β细胞特异性基因表达，促进其分化增殖及再生，抑制凋亡，有效的保护胰岛β细胞的数量及功能等。而无论是1型还是2型糖尿病，胰岛β细胞数量和功能都对其临床进程起着重要作用，故GLP-1被认为是糖尿病治疗具有前景的重要物质之一。Exendin-4是GLP-1受体的长效激动剂，有53％的氨基酸序列与哺乳动物GLP-1重叠，能发挥与GLP-1相近的血糖调节作用，并具有相似的抗细胞凋亡及促胰岛细胞增殖作用。动物实验表明，Exendin-4可以耐受体内二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ，DPP-Ⅳ)的降解，与GLP-1相比具有更长的血浆半衰期，这些特点都为GLP-1及其类似物应用于临床治疗提供了新的契机。而对于T2DM的主要机制之一，脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡，Exendin-4能否发挥保护作用，改善细胞数量及功能，目前相关报道尚少，因此有待进一步的探索研究。　　 本研究在体外环境培养胰岛β细胞株MIN6，应用棕榈酸建立脂毒性环境，探讨Exendin-4对胰岛β细胞生长、凋亡的影响。　　 实验方法:　　 在脂毒性条件下，以不同浓度Exendin-4处理细胞，观察Exendin-4对棕榈酸诱导的MIN6细胞脂性凋亡的保护作用。在脂毒性环境下（棕榈酸0.4mM），CCK8检测不同浓度Exendin-4(1、10、100、500nM)作用24h时间后对MIN6细胞活性的影响，Hoechst33258荧光染色法、AnnexinV-PI双染流式细胞术、TUNEL法检测Exendin-4(100nM)作用24h后细胞的凋亡率，酶联法检测Exendin-4(100nM)作用24h后细胞Caspase-3酶活性。　　 结果:　　 1、在脂毒性条件下，随着Exendin-4浓度的升高，细胞存活率明显升高，并呈一定量效关系，在Exendin-4浓度为100nM时，其促进细胞生长作用最强(P＜0.01)。　　 2、在脂毒性条件下，Exendin-4能显著拮抗棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡(P＜0.01)，并抑制棕榈酸诱导的Caspase-3活性(P＜0.01)。　　 结论:　　 Exendin-4可以促进胰岛β细胞MIN6生长，在脂毒性条件下提高细胞活性。同时Exendin-4可拮抗脂毒性诱导的MIN6细胞凋亡，并降低MIN6细胞的Caspase-3活性。　　 第三部分Exendin-4拮抗脂毒性保护胰岛β细胞的机制研究　　 前言:　　 蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB)与细胞外调节蛋白激酶(Extracellularregulated protein kinases，ERK)分别是在多种组织和细胞中表达的一类丝氨酸/苏氨酸激酶。在胰岛中可促进β细胞的增殖，阻断细胞凋亡通路。大量实验证明了它们在调节胰岛β细胞功能和结构方面扮演着重要的角色。不断有证据显示，通过其自身磷酸化的激活可保护胰岛β细胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。我们的研究显示Exendin-4对于T2DM的主要机制之一，脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡具有保护作用，而Exendin-4这种保护胰岛β细胞的作用机制是否是通过上述信号通路得以实施，有待于进一步的研究。　　 实验方法:　　 1、采用Western blot法检测在脂环境下（棕榈酸0.4mM），Exendin-4干预不同时间、不同浓度(1、10、100、500nM)及在各自信号通路阻断剂存在的条件下，MIN6细胞内p-PKB(ser473)、总PKB，p-ERK1/2、总ERK1/2蛋白水平的表达。再以CCK8检测细胞活性，Hoechst33258荧光染色法、TUNEL法检测细胞的凋亡情况。2、采用Real-time RT-PCR技术检测在脂环境下(棕榈酸0.4mM)及Exendin-4(100nM)干预24h后Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表达。　　 结果:　　 1、0.4mM棕榈酸干预MIN6细胞24h后可见PKB蛋白的磷酸化明显受到抑制(P＜0.01)，而加入100nM的Exendin-4处理细胞后，可见PKB蛋白磷酸化的快速激活，在30min处达到作用高峰(P＜0.05)。Exendin-4浓度依赖性的诱导了PKB蛋白磷酸化的激活，100nM浓度时作用最显著(P＜0.01)。Exendin-4诱导的PKB蛋白磷酸化的激活能显著被PI3K特异性阻断剂(LY294002)所阻断(P＜0.05)。并且，应用Hoechst33258染色法和TUNEL法检测细胞凋亡证明，Exendin-4抑制脂毒性诱导MIN6细胞凋亡的保护作用被PI3K阻断剂所阻断(P＜0.01)。　　 2、0.4mM棕榈酸干预MIN6细胞24h后可见ERK1/2蛋白的磷酸化明显受到抑制(P＜0.05)，而加入100nM的Exendin-4处理细胞后，可见ERK1/2蛋白磷酸化的快速激活，在5min处达到作用高峰(P＜0.01)。Exendin-4浓度依赖性的刺激了ERK1/2蛋白磷酸化的激活，100nM浓度时作用最显著(P＜0.01)。Exendin-4诱导的ERK1/2蛋白磷酸化的激活显著被其阻断剂(PD98059)所阻断(P＜0.05)。并且应用CCK8检测细胞存活率及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡证明，Exendin-4促进细胞生长的作用被ERK1/2阻断剂所阻断(P＜0.05)，且Exendin-4抑制脂毒性诱导MIN6细胞凋亡的保护作用同样被ERK1/2阻断剂所显著阻断(P＜0.05)。　　 3、棕榈酸可显著下调Bcl-2 mRNA的表达(P＜0.01)，上调Bax mRNA的表达(P＜0.01)及促进Caspase-3活性(P＜0.01)。而加入100nMExendin-4能显著促进Bcl-2 mRNA的表达(P＜0.05)，并同时抑制Bax mRNA的表达(P＜0.05)及Caspase-3活性(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、Exendin-4保护MIN6细胞拮抗棕榈酸诱导的脂性凋亡与PI3K/PKB信号通路有关。　　 2、Exendin-4保护MIN6细胞、拮抗脂毒性作用与ERK1/2信号通路有关。　　 3、脂毒性条件下，Exendin-4的抗凋亡作用涉及线粒体途径。　　 小结　　 本研究以小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞作为研究对象，选用体内FFA含量比例较高的棕榈酸为代表建立脂环境，探索脂毒性对胰岛β细胞的损伤作用。通过实验研究证实了棕榈酸可抑制胰岛β细胞的细胞活性，并有诱导其凋亡作用。鉴于β细胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理机制中的重要地位和作用，研究药物是否具备对抗高脂环境诱导β细胞凋亡的作用，即拮抗脂毒性损伤的保护作用便具有重要意义。因此本实验着重研究了GLP-1受体激动剂Exendin-4在此方面的作用，通过研究发现Exendin-4不仅可以促进胰岛β细胞生长，在脂毒性条件下提高细胞活性，且具备拮抗脂毒性诱导胰岛β细胞凋亡的作用。同时为了进一步明确Exendin-4发挥如上保护作用的可能机制，本实验围绕PI3K/PKB信号通路、ERK1/2信号通路及线粒体途径展开研究，证实了该保护作用涉及如上通路。　　 脂毒性诱导的胰岛β细胞凋亡被认为是和肥胖相关的T2DM的主要机制之一，减少脂毒性对胰岛β细胞的损伤可能是一种延缓糖尿病进展和恶化的关键举措。但是，目前应用于临床治疗中具备拮抗脂毒性作用的药物仍然十分有限。我们开展的关于Exendin-4具备保护胰岛β细胞拮抗脂毒性作用的研究，将有助于为临床治疗提供新的思路，旨在从促进β细胞生存的角度出发，减少T2DM中β细胞脂性凋亡的发展。