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【目的】N~6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m~6A)是发生在高等生物RNA中最为普遍的修饰,也是当前RNA领域研究的热点。其修饰过程动态可逆,是由“编码器(Writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”三个元件共同介导,参与了包括RNA剪切、核转运、RNA稳定性和翻译在内的多个生物学过程。人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)是一种环状双链DNA病毒,其中16和18型是两个常见的高危致癌型别,通常参与调控多个生物学过程,最终导致宫颈癌的发生。甲基化转移酶样蛋白3(methyltransferase like protein 3,METTL3)作为甲基转移酶在体内外催化RNA发生m~6A甲基化修饰,参与包括肝癌在内的多个癌发生过程的调节,但其与宫颈癌细胞中人乳头瘤病毒E6/E7蛋白之间的关联尚不清楚。本文主要是通过一系列实验研究宫颈癌细胞中HPV18E6/E7与METTL3之间的调控机制,通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验高通量测序确定与METTL3特异性相互作用的m RNA,最终阐明METTL3介导的m~6A RNA修饰在宫颈癌发生发展过程中的作用机制。【方法】首先,通过双荧光素酶报告系统、RT-q PCR和Western Blotting实验检测了宫颈癌细胞C33A和He La中HPV18E6/E7对METTL3 m RNA和蛋白表达的影响。生物信息学软件预测了METTL3启动子上可能结合的转录因子,并通过双荧光素酶报告系统和染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验检测NR3C1对METTL3启动子的调控作用,随后RT-q PCR和Western Blotting实验检测HPV18E6/E7、NR3C1及METTL3三者在m RNA和蛋白表达水平的调节关系。接着我们通过甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)实验检测METTL3对HPV18E6/E7m~6A甲基化水平的调节,RT-q PCR和Western Blotting实验验证METTL3对HPV18E6/E7转录和翻译水平的影响。之后,通过RIP-q PCR和Western Blotting实验验证YTHDF1对HPV18E6/E7 m RNA作用和蛋白表达的调节。接下来,为进一步明确METTL3在宫颈癌细胞中的作用,我们通过RIP-seq高通量测序筛选了与METTL3相互作用的基因,并通过Me-RIP和RT-q PCR实验检测METTL3对其m~6A甲基化水平和m RNA表达的影响,最后Western Blotting实验检测HPV18E6/E7对其蛋白表达的影响。【结果】HPV18E6/E7可上调METTL3启动子、m RNA和蛋白表达水平,细胞转录因子NR3C1通过结合到METTL3启动子上促进其转录和翻译,并且NR3C1介导了HPV18E6/E7对METTL3的上调作用。HPV18E6/E7本身具有较高的m~6A甲基化水平,并且METTL3对它们m~6A甲基化水平的上调作用依赖酶活性中心。此外,METTL3能上调HPV18E6/E7 m RNA的表达水平,延长半衰期,并促进其蛋白表达。YTHDF1作为reader可与HPV18E6/E7的m RNA相互作用并促进其翻译。RIP-seq高通量测序和Western Blotting实验筛选出与METTL3相互作用的基因PER1,METTL3可调节其m RNA m~6A甲基化修饰抑制转录。除此之外,HPV18E6/E7抑制了PER1的蛋白表达。【结论】本实验主要探究HPV18E6/E7调节的RNA m~6A甲基化在宫颈癌细胞中作用机制。结果表明HPV18E6/E7蛋白上调NR3C1的表达,而NR3C1结合METTL3的启动子并上调其表达。METTL3可增加HPV18E6/E7 m RNA的m~6A甲基化水平,YTHDF1同样能结合HPV18E6/E7的RNA,并促进其翻译,因而它们之间形成一个正反馈通路。进一步实验结果阐明METTL3能够调节抑癌基因PER1的m~6A甲基化修饰,并最终发挥共同促进宫颈癌发生发展的作用。