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1、研究目的牛珀至宝微丸临床治疗感染性休克疗效显著，一氧化氮（NO）及其相关基因在内毒素休克中对血压调节、脏器损伤与修复起重要作用。为探讨牛珀至宝微丸治疗感染性休克的机理是否与一氧化氮及其相关基因相关，本研究从整体水平、细胞、信号转导与基因调控各个层次对牛珀至宝微丸调控一氧化氮及其相关基因进行研究。2、研究内容、方法本实验分在体实验与离体实验二部分。整体实验主要观察牛珀至宝微丸调控NO对内毒素休克血压、脏器损伤及修复的影响。用静脉注射脂多糖内毒素（LPS）1.5mg／kg、腹腔注射D-氨基半乳糖（D-GaLN）100mg／kg造成内毒素休克模型，用牛珀至宝微丸和一氧化氮合酶抑制剂氨基胍（AG）作干预处理，用BL-410生理仪监测血压，用OlympusAU2700型全自动生化分析仪进行肝功能检测，用HE染色观察各脏器的病理形态，用硝酸还原酶法检测血浆NO浓度，同位素标记法测组织匀浆一氧化氮合酶（NOS）活性，免疫组化、Western blot方法检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在各脏器组织内的表达，用Van Gieson法染色检测胶原纤维在肺组织内的表达，免疫组化方法检测肺组织高迁移蛋白（HMGB1）、转化生长因子（TGF-β1）及其受体的表达，并用激光共聚焦扫描显微镜进一步观察高迁移率族蛋白（HMGB1）的表达。离体实验从细胞信号转导与基因调控水平观察牛珀至宝微丸动物血清对LPS刺激RAW264.7iNOS基因转录调控的影响。用硝酸还原酶法检测测定蛋白激酶C（PKC）抑制剂对LPS诱导的NO生成作用，用PKC活性测定法研究LPS对PKC的激活作用；用基因重组技术构建iNOS荧光素酶报告基因载体；用基因转染及报告基因检测等方法研究牛珀至宝微丸调控LPS刺激RAW264.7细胞对iNOS启动子活性的诱导作用及其与PKC的关系，以明确牛珀至宝微丸对LPS刺激RAW264.7细胞iNOS启动子活性的诱导作用及PKC的影响。3、研究结果牛珀至宝微丸对内毒素休克与NO影响结果显示：LPS注射即时血压迅速下降成稳定的低血压，AG有显著的升压作用，用药30min后血压上升接近正常水平，至240min甚至高于原基础血压；牛珀至宝微丸血压回升稳定而缓慢，AG+牛珀至宝微丸有升压作用，但并未叠加，而是使升压作用缓和。LPS组NO浓度持续上升，AG可明显使NO浓度下降迅速而且稳定，注射后30min即回复至正常水平，240min后仍有继续下降趋势。牛珀至宝微丸组NO缓慢上升，其上升幅度高于LPS组而低于正常组。提示牛珀至宝微丸可使内毒素休克鼠血浆NO浓度缓慢下降，抑制NO的过量生成。AG+牛珀至宝微丸的作用叠加无显著意义。iNOS蛋白活性检测结果显示：LPS可致iNOS活性显著增强，AG可抑制iNOS，牛珀至宝微丸可抑制iNOS活性，AG+牛珀至宝微丸其作用有增强趋势。iNOS Western Blotting结果显示：正常组iNOS条带缺如，LPS组iNOS强阳性表达，AG组iNOS表达较弱，牛珀至宝微丸iNOS表达也较弱，但不如AG组明显，AG+牛珀至宝微丸其作用有增强趋势。牛珀至宝微丸对内毒素休克各脏器损伤的形态、功能影响与iNOS关系结果显示：AG对内毒素性肝损伤血清ALT、AST的浓度变化无影响，牛珀至宝微丸则可以明显改善以上肝功能指标及肝脏病理损坏，并能减少肝细胞、枯否氏细胞、内皮细胞的iNOS表达。内毒素休克心脏iNOS阳性细胞分布于心脏外膜与心肌，牛珀至宝微丸能明显降低内毒素所致iNOS表达，并能改善内毒素休克的心脏损害。内毒素休克脑iNOS阳性细胞分布于大脑皮质、纹状体、脑干、小脑等，牛珀至宝微丸能明显降低内毒素脑iNOS表达，并能改善内毒素休克脑损害。内毒素休克肾组织iNOS表达增强，牛珀至宝微丸能明显降低内毒素肾iNOS表达，并能改善内毒素休克肾损害。牛珀至宝微丸对内毒素休克脏器损伤修复与NOS表达关系结果显示：牛珀至宝微丸降低肺组织iNOS活性，使肺内iNOS表达减弱、而且同时能使eNOS表达增强，肺损伤减轻。对内毒素急性肺损伤的修复表明，内毒素肺损伤肺组织胶原纤维染色显著增强，牛珀至宝微丸能减轻肺损伤，并能减弱肺组织胶原纤维染色。内毒素肺损伤与修复的相关因子结果显示：牛珀至宝微丸可增强内毒素休克晚期关键核因子高迁移蛋白（HMGB1）的表达，增强肺组织转化生长因子-β1及其受体表达而不产生纤维化。离体实验从细胞信号转导与基因调控水平研究结果显示：牛珀至宝微丸可负调节LPS刺激RAW264.7细胞引起的PKC磷酸化激活和膜移位，并可延长PKC抑制剂H7下调NO作用时间。荧光素酶报告基因实验结果显示，牛珀至宝微丸可抑制LPS刺激诱导的iNOS启动子的转录活性，并可增强H7和钙离子通道阻滞剂维拉帕米的作用。牛珀至宝微丸抑制LPS刺激RAW264.7细胞所致的NO生成增加，其机制之一是量效与时间两方面抑制PKC激活和细胞内钙增加，从而影响iNOS启动子的转录活性。4、研究结论AG过快、无限制的升压可能对机体不利。牛珀至宝微丸治疗内毒素休克与NO途径相关，但不同于单纯的一氧化氮合酶抑制剂，升压稳定而缓慢，可能更有利于机体恢复，这也说明牛珀至宝微丸有平稳的升压作用不只是单纯的NO作用途径，而且存在某种稳定NO浓度的机制。牛珀至宝微丸治疗内毒素休克各脏器损伤与减少iNOS表达相关，与一氧化氮合酶抑制剂不同的是能使eNOS表达增强；对于内毒素损伤与修复表明，牛珀至宝微丸其机理可能与增强纤维化因子TGF-β1及其受体表达相关，能增强内毒素休克晚期关键核因子HMGB1的表达，其损伤与修复之间可能是通过核因子HMGB1而发生作用。鉴于iNOS的表达主要取决于基因转录水平，研究表明牛珀至宝微丸抑制iNOS启动子转录活性，细胞信号研究表明牛珀至宝微丸可增强PKC抑制剂H7下调NO的作用。本研究的最终结果表明：牛珀至宝微丸对内毒素休克NO影响是一个独特的整体调节机制，而且其靶点主要在细胞核。