论文部分内容阅读
后囊膜混浊(posterior capsular opacification，PCO)是白内障摘除术后最常见的并发症，常常导致术后显著的视力下降。前囊膜上残留的晶状体上皮细胞（lens epitheliumcell，LEC）迁移到后囊膜并进行上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是后囊膜混浊发生的病理学基础。 上皮间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞向间质细胞发生转化，即上皮细胞失去上皮特征而获得间质细胞表象的现象。EMT不仅参与胚胎发育、创伤修复，而且在多种疾病的发生发展过程中也起着重要的作用。多个信号通路参与EMT过程，其中包括Notch信号通路。1917年，Morgan及其同事在果蝇体内发现一种基因，因其功能部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口，故命名该基因为Notch。Notch基因胞内段(Not ch Intracellular Domain，NICD)为其活化形式，NICD移至核内行使影响靶基因的转录功能，其中包括促进Snail的表达。 近年，Notch1/Snail通路在多种疾病中的作用均有报导，尤其在组织器官纤维化及肿瘤疾病上皮间质化的发生发展过程中均中起到重要作用。这些研究表明，Notch1/Snail通路下调E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，进而促进了EMT的发生发展。但目前，Notch1/Snail/E-cadherin信号通路对人晶状体上皮细胞EMT的调控作用尚不十分明确，本研究在总结前人工作基础上，对Notch1/Snail/E-cadherin信号通路在PCO发生发展中可能存在的调节作用及相关机制进行探讨。为PCO的发生、发展的病理机制和预防、治疗提供一条新的思路。 目的: 1、明确在人晶状体上皮细胞间质转化过程中Notch1，Snail，E-cadherin各指标有无表达。 2、明确Notch1信号上调对人晶状体上皮细胞增殖，迁移及侵袭能力的影响。 3、明确Notch1/Snail/E-cadherin信号通路是否能促进人晶状体上皮细胞间质转化及其调节机制。 方法: 1、Notch1，Snail，E-cadherin在氯化钴刺激的SRA01/04人晶状体上皮细胞间质转化中的表达及意义。以氯化钴处理的SRA01/04细胞为实验组，以未用氯化钴处理的SRA01/04细胞为对照组。动态观察细胞形态学改变，PCR及WB方法检测低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)，Snail，E-cadherin的mRNA和蛋白表达。用WB方法检测角蛋白（keratin，上皮标记物），纤连蛋白（fibronectin，间质转化指标）和Notch1的蛋白表达。统计学方法统计以上各指标在两组中的表达有无差异。 2、Notch1信号上调对人晶状体上皮细胞增殖，迁移，侵袭功能的影响。2.1、Notch1基因胞内活化部分真核表达载体p3×FLAG-CMV-7-NICD1的构建与鉴定。从SRA01/04细胞提取总RNA，逆转录合成cDNA，NICD1全长序列扩增，p3×FLAG-CMV-7载体和NICD1片段酶切、连接，转化感受态细胞DH5α，p3×FLAG-CMV-7-NICD1质粒提取，经酶切、测序鉴定质粒构建成功，为下一步实验提供基础。2.2、Notch1信号上调对人晶状体上皮细胞增殖，迁移，侵袭功能的影响。通过向SRA01/04细胞转染质粒p3×FLAG-CMV-7-NICD1，模拟Notch1信号上调。通过MTT实验、细胞划痕实验，Transwell实验研究Notch1信号上调后对人晶状体上皮细胞增殖，迁移和侵袭能力的影响。 3、Notch1/Snail/E-cadherin信号通路促进人晶状体上皮细胞间质转化过程及其调节机制的研究。3.1、Notch1/Snail/E-cadherin信号通路促进人晶状体上皮细胞间质转化过程的研究。通过向SRA01/04细胞转染质粒p3×FLAG-CMV-7-NICD1，模拟Notch1信号上调。动态观察转染细胞形态学改变，WB方法检测Notch1，角蛋白，纤连蛋白和磷酸化GSK-3β的表达。明确Notch1上调能否通过促进GSK-3β磷酸化刺激SRA01/04细胞发生上皮间质转化。3.2、Notch1/Snail/E-cadherin信号通路促进人晶状体上皮细胞间质化调节机制的研究。以氯化锂处理p3×FLAG-CMV-7-NICD1转染的SRA01/04细胞株为实验组，以未用氯化锂处理的p3×FLAG-CMV-7-NICD1转染SRA01/04细胞株为对照组，通过RT-PCR、WB方法检测Notch1，Snail及E-cadherin的表达。明确GSK-3β及其抑制剂氯化锂对Notch1/Snail/E-cadherin信号的调节机制。 结果: 1、在氯化钴处理的SRA01/04人晶状体上皮细胞间质转化过程中HIF-1α，Snail的mRNA和蛋白表达增高，E-cadherin的mRNA和蛋白表达降低。纤连蛋白表达增高，角蛋白表达降低。差异有统计学意义。Notch1在实验组和对照组中都有蛋白表达，差异无统计学意义。 2、酶切和测序结果及WB结果提示NICD1基因已成功克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-7中。该载体转染SRA01/04细胞模拟Notch1信号上调后，实验组转染细胞增殖数比对照组多，实验组细胞迁移距离比对照组长，实验组细胞透膜细胞数比对照组多，差异有统计学意义。 3、Notch1信号上调后，SRA01/04细胞在形态上极性消失，细胞间连接减少。纤连蛋白和磷酸化GSK-3β表达增多，角蛋白表达下降。Notch1，Snail的mRNA和蛋白表达增多，E-cadherin的mRNA和蛋白表达下降。实验组和对照组差异均有统计学意义。经氯化锂处理的转染SRA01/04细胞中，Snail表达进一步增加，E-cadherin表达进一步下降。 结论: 1、氯化钴通过作用于HIF-1α使Snail转录表达增高，E-cadherin的转录表达减少，促进人晶状体上皮细胞SRA01/04发生间质转化。Notch1，Snail，E-cadherin各指标在氯化钴诱导的人晶状体上皮细胞间质转化的过程中都有表达。 2、成功构建p3×FLAG-CMV-7-NICD1真核表达载体。Notch1信号上调增强人晶状体上皮细胞增殖，迁移及侵袭能力。 3、Notch1/Snail/E-cadherin存在于人晶状体上皮细胞EMT过程之中，而且能够刺激人晶状体上皮细胞发生间质转化。Notch1上调可以通过促进GSK-3β磷酸化，促进Snail表达，降低E-cadherin表达，进而促进EMT发生。而加用GSK-3β的抑制剂氯化锂，可以加速Notch1/Snail/E-cadherin信号通路诱导的EMT的进程。