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棉花黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的土传性病害,是限制我国棉花生产的主要因素之一。寻找高效环保的防治棉花黄萎病的途径是目前解决棉花产业可持续发展的首要任务。本课题组在实验室培养大丽轮枝菌过程中发现培养大丽轮枝菌的平皿上长满了细菌,而大丽轮枝菌被完全吞噬,所以初步推测该平皿中具有能够抑制大丽轮枝菌的细菌。为了验证这一假想,利用平板划线分离法从该平皿上分离、纯化得到六株细菌,分别将其编号为T1、T2、T3、T4、T5、T6。通过平皿对峙试验、倒扣平皿试验、孢子混合发酵液共培养和盆栽试验,测试这六株菌的抑菌活性。实验结果显示:T1～T6菌株的抑菌率分别为11.6%、28%、6.7%、10.7%、58%和75%。进一步对活性最高的T6菌株采用气质联用分析活性跟踪测试等对其活性因子进行探究。结果表明:T6菌株的拮抗毒力因子主要为挥发性物质。通过GC-MS气质联用和纯品验证实验证实,T6菌株产生的苯乙烯是其重要的拮抗毒力因子。利用转录组和定量PCR从分子水平探究苯乙烯的抑菌机理,结果证实了经过苯乙烯诱导后大丽轮枝菌中与转运和降解相关基因发生了表达变化,抑制了大丽轮枝菌生长。最后,根据各菌株抑菌活性因子分析结果,选用分离筛选得到的六株菌和实验室已有的大丽轮枝菌拮抗菌株肠杆菌Enterobacteriaceae sp.V1等进行混合配比,组成有不同抑菌活性机理的混合菌,通过平皿对峙实验和盆栽实验等测试活性,以期达到不同菌株协同互补,增强抗病的效果。本研究主要成果如下:（1）拮抗菌株的分离、筛选及鉴定。从污染的大丽轮枝菌平板中分离筛选到6株细菌,通过形态学鉴定和16S r RNA序列比对分析,分别鉴定为葡萄球菌Staphylococcus sp.T1、芽孢杆菌Bacillus sp.T2、微杆菌Microbacterium sp.T3、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.T4、博德特氏菌Bordetella sp.T5和芽孢杆菌Bacillus sp.T6。T1～T6菌株发酵液对大丽轮枝菌的孢子萌发抑制率分别为7.18%、27.54%、0、11.78%、43.25%和67.15%。盆栽实验表明,T1～T6与对照组相比发病率分别下降10.32%、20.89%、3.77%、3.45%、58.89%和59.11%;病情指数分别降低10.90%、43.00%、11.96%、6.85%、79.30%和82.61%。菌株T5和T6可以显著提高陆地棉TM-1对黄萎病的抗性。T2菌株提高陆地棉TM-1对棉花黄萎病的抗性较弱,T1、T3、T4菌株并不能提高陆地棉TM-1对黄萎病的抗性。（2）T6菌株的活性因子初探。实验证实T6菌株没有接触即可抑制大丽轮枝菌活性,从而推测该菌的活性因子可能为挥发性物质。收集T6菌株产生的气体送样至山东青岛科创质量检测有限公司进行气质联用（GC-MS）分析,共得到T6菌株产生的46种气体。将相似度大于90和相对含量高于1%的气体,筛选出了12种气体纯品验证了其中11种纯品。纯品验证实验确定了T6菌株产生的苯乙烯（Styrene）为其主要的毒力因子。（3）T6菌株的拮抗机制初探。制备苯乙烯（99%）诱导2 h、2.5 h、3 h和无诱导大丽轮枝菌共四组样品,送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序分析。转录组数据显示检测了10812个基因,其中有3367个基因表达量发生了变化。苯乙烯分别诱导2 h、2.5 h及3 h时,大丽轮枝菌中分别有907、1156及1304个基因的表达水平发生了变化。其中有三个诱导时间段样品中均发生下调的基因有72个,包含了2个几丁质酶基因、2个蛋白酶基因、5个转运相关基因及33个假想蛋白基因;三个诱导时间段样品中均发生上调的基因有247个,具体包含4个水解酶基因、8个脱氢酶基因、11个还原酶基因、17个与转运转移相关的基因及142个假想蛋白基因。根据表达量上调幅度和功能,筛选出四个潜在的抑菌相关基因,分别是VDAG＿02838基因,与BTB结构域相关,具有降解转录调控、染色质重塑、蛋白质降解功能;VDAG＿09554基因,与DNAJ蛋白相关,在蛋白质的翻译、折叠、展开、移位和降解等过程中发挥着重要作用;VDAG＿04557基因,与溶菌酶相关基因在自然界中广泛存在具有抗真菌、抗细菌的功效;VDAG＿08251基因,与多聚腺苷酸化因子I复合物相关。q PCR结果证实以上四个基因经苯乙烯诱导后表达量均发生了上调:VDAG＿02838、VDAG＿09554、VDAG＿04557和VDAG＿08251基因相对对照组分别上调了3.18、78.83、2.71和2.92倍。该研究结果初步从分子水平探究了T6菌株的抑菌机理。（4）构建混合菌系及活性验证。亲和实验证实前期筛选获得的抑制大丽轮枝菌生长的肠杆菌Enterobacteriaceae sp.V1和本研究中获得的T6菌株有较好的亲和性。将V1和T6菌株按照不同的比例混合涂布平皿,测试混合菌株对大丽轮枝菌的抑制活性。实验结果表明:菌株V1和T6在OD600=0.8、体积比为1∶3时混合菌的抑菌率达80.5%,和T6单株菌（抑菌率75%）相比提升了5.5%,相比于V1单株菌株（抑菌率61.0%）提升了19.5%。其他组合的混合菌均没有显示出比单株细菌T6更高的抑菌活性。盆栽实验结果证实V1、T6混合菌在棉花土壤根部还可以促进棉花的生长。混合菌处理后,棉花的根长达到了20.3 cm,比正常生长的棉花根长19.5 cm增长了28.5%;比T6菌株处理的棉花根长19.2 cm增长了5.72%;比V1菌株处理棉花根长20.1 cm增长了0.9%。混合菌株处理后的棉花茎长达到了22.9 cm,比正常生长棉花茎（长19.5cm）增长了16.9%;比T6菌株处理的棉花茎（长19.7 cm）增长了16.2%;比V1菌株处理棉花茎（长20.1 cm）增长了0.4%。对混合菌的促生长能力进行测定。结果表明:V1菌株能够在固氮培养基中生长,而T6菌株不能生长;V1菌株在无机磷培养基中生长后显示明显透明圈、T6菌株则没有透明圈;两株细菌均不可在有机磷培养基、固钾培养基上生长。用吲哚乙酸显色剂Fe Cl3检测各菌株发酵液,结果均没有变色,从而说明待测菌株均没有产生吲哚乙酸。V1菌株具有固氮和解无机磷能力,不具备解有机磷、解钾和产生长素能力;T6菌株不具备固氮、解磷、解钾和产生长素能力。最后,测试混合菌对其他植物病原菌的防治效果。利用混合菌对将苹果霉心病主要病原菌棒盘孢菌、树木溃疡病主要病原菌盾壳霉、枣果褐斑病病原菌主要病原菌极细枝孢霉进行平皿对峙实验,抑制效果分别达到了66.7%、13.3%、33.3%。