精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）是位于雄性动物睾丸曲细精管基膜,既能自我更新维持自身数量恒定,又能定向分化产生精子的一类原始精原细胞,在雄性动物睾丸中只占极少的比例,但对雄性生育力的维持发挥至关重要的作用。目前保存雄性动物生育力通常使用冷冻保存精子的方法来实现,但对于无精、少精症及性成熟前雄性动物而言,冷冻保存SSCs是一种有效的替代方法。通常使用液氮冷冻保存法（-196℃）对细胞进行冻存,在冻存过程中会受到低温、氧化应激等外界环境的刺激,导致解冻后细胞活率下降,进而影响细胞功能甚至导致细胞凋亡。SSCs冷冻保存可为优良畜禽的种质资源保存提供有效的途径,但目前冷冻保存SSCs的技术尚不成熟,关于如何提高SSCs冷冻保存效果的研究相对较少。现今对于SSCs冷冻保存的研究多集中在小鼠、大鼠等动物上,山羊等大型家畜的SSCs冷冻保存研究报道较少。褪黑素具有降低细胞氧化应激,减少细胞凋亡,抵抗炎症,调节昼夜节律和自噬等作用,常应用于细胞体外培养及精子冷冻保存,调节细胞增殖及发挥抗氧化等作用。然而,在奶山羊SSCs冷冻保存中褪黑素的作用还未见报道,仍需进一步研究。因此,本研究首先筛选基础冻存液配方,然后在最佳基础冻存液中添加褪黑素,旨在通过改善细胞冷存液配方来提高SSCs冷冻保存效果。本研究采用2～2.5月龄关中奶山羊睾丸,利用机械分离法、两步酶消化法和差速贴壁法获取奶山羊SSCs,随后将得到的SSCs利用液氮进行冷冻保存。通过流式细胞术、Western Blot、透射电镜等探究细胞氧化、凋亡及自噬的情况,初步揭示褪黑素在奶山羊SSCs冷冻保存过程中提高冷冻保存效果的机制。本试验主要获得以下研究结果:1. 通过机械分离、两步酶消化结合差速贴壁法分离获得奶山羊SSCs,利用免疫荧光染色对分离后的SSCs进行鉴定,大量细胞表达SSCs分子标记THY1和PLZF,表明可获得较高纯度的SSCs。2. 通过比较三种基础冷冻保存液对奶山羊SSCs冷冻保存效果,表明冻存液Ⅱ解冻后细胞活率显著大于冻存液Ⅲ（P<0.05）,冻存液Ⅱ解冻后细胞活率高于基础冻存液Ⅰ,但差异不显著（P>0.05）。因此,最佳基础冻存液为含有DMSO和FBS的冻存液Ⅱ,冷冻-解冻后细胞活率达到55.77%。3. 通过台盼蓝染色检测SSCs活率,结果表明在基础冻存液Ⅱ中添加浓度为10^-6mol/L褪黑素时SSCs活率提高到68.99%,显著高于其他处理组（P<0.05）。相比于对照组,添加褪黑素的处理组均能不同程度提高细胞的抗氧化水平;相比于其他处理组,在基础冻存液Ⅱ中添加10^-6mol/L褪黑素能够显著减少细胞内ROS和MDA的含量（P<0.05）,且显著提高T-AOC和线粒体膜电位（P<0.05）,表明冻存液中添加褪黑素能够显著提高SSCs的抗氧化能力,且褪黑素最佳添加浓度为10^-6mol/L。4. 为了进一步探究添加褪黑素提高解冻后SSCs活率的分子机制,本试验通过以下三种途径进行研究。通过Western Blot检测抗氧化酶的表达水平,结果表明添加10^-6mol/L褪黑素时过氧化氢酶（CAT）蛋白表达量极显著高于对照组（P<0.01）,超氧化物歧化酶（SOD1、SOD2）和谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx5）蛋白表达量显著高于对照组（P<0.05）;通过对细胞凋亡的信号级联通路进行分析发现,添加褪黑素能够显著减少线粒体肿胀及空泡化,抑制线粒体中细胞色素C（Cyt c）释放至胞质,进而显著抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达水平（P<0.05）,提高抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-XL）的表达水平（P<0.05）;通过透射电镜结合Western Blot技术分析解冻后细胞自噬情况,表明添加褪黑素能够显著抑制细胞自噬泡的产生以及自噬相关蛋白（LC3-?、LC3-??、BECN1、ATG7）的表达（P<0.05）。这些结果表明,在细胞冻存液中添加褪黑素能够通过维持细胞抗氧化还原平衡,抑制细胞凋亡和抑制自噬泡产生来提高解冻后SSCs的活率。以上结果表明,冻存液Ⅱ为最佳基础冻存液,在冻存液Ⅱ中添加褪黑素能够有效提高冷冻-解冻后SSCs活率,其中添加10^-6mol/L褪黑素细胞活率最高,达到68.99%。基础液中添加褪黑素能够通过减少精原干细胞ROS产生,提高抗氧化酶蛋白表达来提高SSCs抗氧化能力;通过减少Cyt c从线粒体释放至细胞质,减少促凋亡蛋白的表达,提高抗凋亡蛋白的表达来减少SSCs凋亡;此外褪黑素可减少细胞自噬泡产生,减少促自噬蛋白表达。总之,褪黑素通过提高细胞抗氧化、抗凋亡和减少细胞自噬三方面作用来提高奶山羊SSCs的冷冻保存效果。