【摘 要】
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蜜蜂败血病是由蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）引起的一种常见蜜蜂疾病。通常,感染的死亡率高达90%以上,被认为是危害蜜蜂养殖最严重的疾病之一。而目前大多还是使用如头孢类和四环素类等抗生素来治疗该病菌所致的蜜蜂疾病,由此会使蜜蜂产生耐药性并在蜂蜜中残留抗生素进而威胁人类健康。卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）源于卵生动物,作为一种血清抗体,主要是在血液中合成然后
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蜜蜂败血病是由蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）引起的一种常见蜜蜂疾病。通常,感染的死亡率高达90%以上,被认为是危害蜜蜂养殖最严重的疾病之一。而目前大多还是使用如头孢类和四环素类等抗生素来治疗该病菌所致的蜜蜂疾病,由此会使蜜蜂产生耐药性并在蜂蜜中残留抗生素进而威胁人类健康。卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）源于卵生动物,作为一种血清抗体,主要是在血液中合成然后转移到蛋黄中,具有研制周期短、成本低、理化性质稳定等特点。本研究以蜂房哈夫尼菌为基础,探究了培养蜂房哈夫尼菌的最优条件;以灭活的蜂房哈夫尼菌为抗原,免疫蛋鸡制备IgY;IgY分离和纯化后,通过检测其抗体效价、纯度和其中特异性抗体的含量来对IgY进行评价;建立和优化了蜂房哈夫尼菌间接ELISA检测方法;通过考察体外抗菌的效果,研究特异性IgY在体外对蜂房哈夫尼菌的生长抑制作用;通过蜜蜂口服,考察了特异性IgY对感染蜂房哈夫尼菌蜜蜂的治疗效果。主要结果如下:（1）蜂房哈夫尼菌培养基的最优成分为:碳源为2%葡萄糖,氮源为2%蛋白胨,氯化钠添加量为4%,因素主次顺序为蛋白胨>氯化钠>葡萄糖。生长条件单因素和正交分析结果显示,蜂房哈夫尼菌培养的最优条件是温度为35℃、p H=8、摇床速度为200 rpm;（2）先后采用五种方法分离和纯化的特异性IgY,其中聚乙二醇沉淀法分离和纯化的特异性IgY具有较高纯度,测得IgY的浓度为9.94 mg/m L。首次免疫后第7周的ELISA结果显示:卵黄抗体原液的效价为1:3276800,而冻干粉复溶的效价为1:819200;（3）建立和优化蜂房哈夫尼菌特异性IgY间接ELISA检测方法。利用已知的抗蜂房哈夫尼菌特异性IgY和非特异性IgY对建立的间接ELISA测定方法提升改进。改进后的ELISA程序如下:用包被液稀释过的灭活蜂房哈夫尼菌包被,稀释至1×10~6CFU/m L,置于37℃放置1 h后于4℃过夜。封闭加入0.2%BSA,37℃封闭2 h。一抗为1:1000稀释的冻干粉复溶的特异性IgY,37℃反应1 h。酶标二抗为1:8000稀释,37℃反应1 h。底物显色10 min。按优化后的ELISA操作流程对不同稀释梯度的蜂房哈夫尼菌破碎上清进行检测,确定了该方法的阳性临界值为0.5989,阴性临界值为0.6471,介于0.6～0.65结果存疑,可疑样品应重复检验,若重检结果仍可疑,则判为阴性。符合率结果均大于95%。当强阳性样品的稀释度为1:3200时,结果仍为阳性。弱阳性样品稀释度为1:800时结果仍为阳性。（4）特异性IgY对蜂房哈夫尼菌的体外抗菌结果显示,与对照组和非特异性IgY相比,10 mg/m L特异性IgY能显著抑制蜂房哈夫尼菌在液体培养基中的生长。动物实验表明,与对照组和非特异性IgY相比,含特异性IgY的蜂粮对攻毒后的蜜蜂的保护和治疗效果明显,特异性IgY对感染蜂房哈夫尼菌的蜜蜂具有明显的保护能力,其保护率达到了95%以上,而同时通过幼虫芽孢杆菌和沙门氏菌的感染（存活率均低于20%）,也验证了其保护效果具有特异性。
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