金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)简称金葡菌,是引起医院感染和社区获得性感染的重要致病菌,能够引起皮肤及软组织感染,也可引起全身性感染。近年来,随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等耐药菌株的出现,金葡菌感染呈现发病率高、耐药性强、治疗困难、致死率高的态势。金葡菌感染过程中,毒力因子的分泌是其毒力发挥的重要环节。Ⅶ型分泌系统(typeⅦsecretion system,T7S system,T7SS)是存在于金葡菌中重要的蛋白质分泌途径,参与金葡菌毒力因子的跨膜转运,与金葡菌的毒力作用密切相关,深入研究金葡菌Ⅶ型分泌系统及其分泌机制对于有效防控金葡菌感染具有重要意义。Ⅶ型分泌系统是在研究结核分枝杆菌减毒疫苗株的过程中发现的。Sherman等发现RD1区域的丢失是结核分枝杆菌减毒株毒力减弱的遗传学原因,进一步研究发现RD1区域编码蛋白构成了一个蛋白分泌系统,继Ⅰ-Ⅵ型分泌系统之后,将其命名为Ⅶ型分泌系统。因Ⅶ型分泌系统与结核分枝杆菌和金葡菌等重要的致病菌毒力密切相关而受到越来越广泛的关注。长期以来对Ⅶ型分泌系统的研究主要集中于结核分枝杆菌。在结核分枝杆菌中发现了esx-1~esx-5五个同源编码基因簇。继结核分枝杆菌之后,Pallen等人在金葡菌等多种革兰阳性菌中都发现了类似的同源结构。金葡菌Ⅶ型分泌系统基因簇包含多个基因,编码的蛋白包括金葡菌Ⅶ型分泌系统效应分子、膜蛋白及其他分泌相关组分。金葡菌Ⅶ型分泌系统的功能发挥受到多种因素的严格调控。研究表明,金葡菌附属基因调节子(accessory gene regulator,agr)影响Ⅶ型分泌系统的分泌因子EsxA的转录,在金葡菌中与esx A位于同一基因簇上的其他Ⅶ型分泌系统相关基因编码蛋白与EsxA关系密切,agr对这些基因的作用尚不清楚,探讨agr系统对金葡菌Ⅶ型分泌系统的调控作用有助于增进对金葡菌Ⅶ型分泌系统的认识。探寻Ⅶ型分泌系统分泌机制,对其组分之间的相互作用研究必不可少。噬菌体展示文库技术是研究蛋白质之间相互作用、核酸与蛋白质相互作用的重要工具,为研究Ⅶ型分泌系统膜蛋白之间的相互作用,我们构建了金葡菌噬菌体展示文库。文库的构建还可用于金葡菌的其他研究工作。本论文研究内容分为两部分,第一部分采用蛋白质的原核表达方法体外表达金葡菌Ⅶ型分泌系统组分essb、essa、esab的重组蛋白,继而免疫小鼠获得相应的抗体。随后,采用rt-pcr及westernblot方法检测金葡菌agr缺失对Ⅶ型分泌系统相关组分转录和表达水平的影响。第二部分采用噬菌体展示技术构建了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus,mrsa)n315菌株的cdna文库。本研究主要获得了以下结果:1、agr功能缺失对金葡菌Ⅶ型分泌系统影响的初步研究1)Ⅶ型分泌系统膜复合物蛋白essb、essa、esab抗体的制备:①分析Ⅶ型分泌系统膜基因结构,采用pcr的方法克隆相关组分蛋白质essb、essa、esab的编码基因。②通过酶切连接的方法将编码基因片段分别克隆入表达质粒pet-22b(+)、pet-30a(+)获得重组表达质粒,重组表达质粒转化大肠杆菌bl21获得重组蛋白表达菌。③iptg诱导重组菌表达重组蛋白,优化表达条件,获得的工程菌表达产物经鉴定均以包涵体的形式表达。④表达得到的重组蛋白包涵体经ni-柱亲和层析纯化后,sds-page鉴定。⑤纯化后的蛋白溶液经透析复性,bca法蛋白定量后,冻存备用。⑥用纯化后的蛋白溶液免疫balb/c小鼠,制备重组蛋白抗体,elisa法评价抗体的效价,加等体积甘油冻存备用。2)agr功能缺失对金葡菌Ⅶ型分泌系统影响的初步研究:以金葡菌临床分离株xq野生株及传代获得的agr功能缺失株xqm株为研究对象。①荧光定量pcr检测野生株和agr缺失株Ⅶ型分泌系统结构组分蛋白esaa和分泌蛋白esxa、esxb、esac的转录水平,结果显示agr功能缺失株中Ⅶ型分泌系统编码基因esaa、esac、esxa、esxb的转录水平均低于xq野生株。②westernblot检测Ⅶ型分泌系统膜复合物蛋白essa、esaa和分泌蛋白esxb、esac的表达水平。结果显示,agr功能缺失株中膜蛋白essa和分泌蛋白esxb的表达水平明显低于xq野生株,而esaa及分泌蛋白esac的表达水平没有明显差别。2、n315菌株t7噬菌体cdna展示文库的构建。1)cdna文库的构建:①采用tripure法提取金葡菌n315的总rna,总rna用dnasei消化去除基因组dna污染,之后分离纯化mrna,mrna反转录制备cdna两条链并苯酚/氯仿/异戊醇抽提后,乙醇沉淀。②在cdna末端定向添加ecorⅠ/hindⅢ接头,并双酶切处理获得粘端cdna片段。③处理好的cdna连接t7select10-3载体后体外包装t7噬菌体,构建成原始cdna文库,原始重组克隆铺板扩增获得噬菌体扩增文库。2)c DNA文库的初步评价:①双层平板实验测定文库库容。结果显示原始文库的重组克隆数为1.335×106 pfu,扩增文库的噬菌体滴度为3.26×1010 pfu/ml。②PC R扩增及测序鉴定文库质量,文库阳性插入率达到100%;插入片段大小均匀分布在300-2000 bp之间,可用于后续的筛选实验。综上所述,我们通过对野生株和agr功能缺失株的比较,初步明确了agr功能缺失导致金葡菌Ⅶ型分泌系统膜蛋白Ess A和分泌蛋白EsxB的表达水平明显降低。这是继agr敲除导致Ⅶ型分泌系统分泌蛋白EsxA转录水平降低的报道之后,agr对Ⅶ型分泌系统影响的新证据。另一方面,我们成功构建了金葡菌N315菌株的c DNA展示文库,可用于研究Ⅶ型分泌系统膜蛋白之间的相互作用。以上结果拓展了我们对于金葡菌Ⅶ型分泌系统的认识并为后续的研究工作奠定了基础。