【摘 要】
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为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa),对基因工程菌株E.coliBL21 (DE3) pET22b-mETIa的表达条件进行了优化,成功地进行了高密度发酵,重组蛋白占菌体总蛋白的40 ﹪以上.
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为了大量制备重组刺桐胰蛋白酶抑制剂a(rETIa),对基因工程菌株E.coliBL21 (DE3) pET22b-mETIa的表达条件进行了优化,成功地进行了高密度发酵,重组蛋白占菌体总蛋白的40 ﹪以上.经菌体破碎、包涵体变性、复性,二步柱层析纯化得到电泳纯的rETIa蛋白.活性分析表明rETIa对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和tPA缺失突变体(NTA)均具有较强的抑制作用.同源模建了rETIa的高级结构,初步确定了rETIa与tPA及其突变体相互作用的结构基础.利用rETIa蛋白作为配体制成rETIa-Sepharose 4B亲和层析柱.直接一步纯化NTA复性液,纯化的NTA纯度达90﹪以上,收率为96.2﹪,纯化倍数为13.2,比活为565.7±71.3 IU/μg.从而改进了NTA的分离纯化工艺.利用RACE技术,从直隶环毛蚓中克隆得到了一个新的抗菌肽基因,我们将其命名为Pp-1.利用麦芽糖结合蛋白表达系统融合表达了Pp-1,利用该融合蛋白制备了抗PP-1的多克隆抗体.利用该抗体,在直隶环毛蚓的体表黏膜检测到了抗菌肽PP-1的免疫阳性反应.通过RT-PCR分析初步确定了Pp-1基因主要在直隶环毛蚓体壁特异性表达.这些结果说明这种抗菌肽可能在直隶环毛蚓体表上皮免疫防御中起到重要的作用.此外,利用蛋白A表达系统融合表达了抗菌肽Magainin I.
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