大洋性金枪鱼和三文鱼的分子鉴定技术研究

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大洋性金枪鱼和三文鱼具有较高的营养价值,近年来国际、国内该类产品的消费也逐渐上升。除了优质金枪鱼和三文鱼种类外,与金枪鱼属于同一科的鲔、扁舵鲣、东方狐鲣等种类,与三文鱼的亲缘关系比较近的狗鱼、鳓鱼等种类,也都常用于生产金枪鱼或三文鱼罐头和鱼酥等产品。但是,不同原鱼料所生产的鱼类产品的营养价值和过敏物质含量有很大不同,价格千差万别,因其引发的鱼类产品安全性问题也成为关注的焦点。虽然很多国家都有相应标签明确的法规,但是掺假造假的判定标准和标签制度的有效实施,都必须建立在准确、快速的鱼类种类鉴定的基础上。为杜绝某些商贩以劣质充当优质种类的欺诈非法行为,保障消费者的购物知情权益,迫切需要灵敏和可靠的检测方法和体系来鉴定金枪鱼和三文鱼食品的物种来源。本文以金枪鱼和三文鱼两类样品为研究对象,阴性对照分别为与金枪鱼或三文鱼亲缘关系相近的鱼类,采用传统定性PCR技术和双重荧光定量PCR技术对样品种类进行检测。在双重荧光定量PCR检测体系中选择的特征基因是线粒体16S rDNA以及CR基因。本研究还通过环等温扩增技术(LAMP)对三文鱼的CR基因进行了扩增,首次探究LAMP技术在鱼类物种鉴定方面的应用。首先,在金枪鱼双重荧光定量PCR检测体系中,将16S rDNA作为金枪鱼属鉴定的属特征基因,CR作为5种主要经济金枪鱼类(蓝鳍金枪鱼、大目金枪鱼、长鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼和鲣)鉴定的种特征基因。金枪鱼属以及5种主要经济金枪鱼类作为检测对象,亲缘关系较近的青干金枪鱼、扁舵鲣、圆舵鲣、东方狐鲣、鲔以及条纹四鳍旗鱼作为阴性对照样品。结果显示,金枪鱼的属特征基因以及5种主要经济金枪鱼类的种特征基因均能在该双重体系中成功检测出,并通过传统PCR扩增、克隆测序进一步验证了所建立体系的检测准确性和可行性。其次,本研究将双重荧光定量PCR技术运用到中国市场上三文鱼种类检测领域。经过搜索已报道的三文鱼基因信息,通过比对分析,选择16S rDNA作为鲑科鱼类的科特征基因,CR作为4种主要经济三文鱼类(大西洋鲑、虹鳟、狗鲑和红鲑)的种特征基因,设计出特异性的荧光定量PCR引物和探针,建立双重荧光定量PCR的三文鱼检测体系。该体系中鲑科以及4种主要经济三文鱼类作为检测对象,与鲑科亲缘关系较近的狗鱼科以及鳓鱼科作为阴性对照组。鲑科的科特征基因以及4种主要经济三文鱼类的种特征基因均能在该双重体系中成功检出。并通过传统PCR测序,证实了体系检测结果的可信性。双重荧光定量PCR体系可以一次检测出两种特征基因,提升了检测的便捷性,为我国金枪鱼、三文鱼市场中掺假产品种类的快速检测提供了技术支持。最后,首次将环等温扩增技术运用到三文鱼种类检测方面,对主要经济三文鱼类的CR基因进行LAMP引物设计,建立大西洋鲑环等温扩增检测体系。在该体系中选择大西洋鲑作为检测对象,与其亲缘相近的虹鳟、狗鲑和红鲑作为阴性对照组。大西洋鲑的种特征基因可以通过扩增检测出来,并且传统PCR以及荧光定量PCR的结果也验证了环等温扩增大西洋鲑检测结果的可信性。虽然该技术操作简便,快速,但是重复性较差,假阳性较高等因素限制了该技术的发展,其检测体系还需要进一步的优化和提高。
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