焦虑是机体对外界可见的或者未知的刺激作出的一种生理心理反应,它是属于机体的正常反应,但是当焦虑情绪的程度以及持续时间超过一定范围则转化为病理性焦虑,即焦虑症。焦虑症主要表现是患者持续感到担忧、恐惧、紧张不安或灾难临近等不良情绪。正常的焦虑情绪能够增加机体自我防卫意识,减少或者避免伤害。而过度的焦虑会给人们的日常生活,社交,工作等带来负面影响。目前临床上用于治疗焦虑症的方案是非常有限的并且疗效不是十分突出,同时也伴随着严重的不良反应。例如临床上使用较多抗焦虑药物地西泮,地西泮的长期使用会带给患者一定的依赖性和一系列副作用,包括导致患者认知功能障碍以及呼吸抑制等。因此,寻找安全性高,治疗效果更好,副作用较少的抗焦虑药迫在眉睫。有研究表明N-甲基-N-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体主要分布在突触后介导兴奋性信号的传递,并且对神经元的突触可塑性有一定的调节作用。氯胺酮能够直接的阻断NMDA受体,产生较好的抗焦虑作用。但是氯胺酮的使用会给患者带来巨大的心理刺激和精神错乱的风险。因此,间接的阻断NMDA受体达到部分拮抗NMDA受体的生理作用成为科学家研究的热点。神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)和突触后密度蛋白95(post-synaptic density protein 95,PSD-95)稱联作为 NMDA 受体下游重要的信号通路。nNOS在神经元上广泛的表达,在神经干细胞和部分星型胶质细胞上也是存在的。nNOS 通过氮端的 PDZ(post-synaptic density protein discs-large,ZO-1)结构域与PSD-95结合形成nNOS-PSD-95复合物。PSD-95是一种能够介导突触可塑性,并且能够调节树突棘发生和突触稳定性的一类突触蛋白。突触后膜的nNOS和PSD-95耦联能够调节突触的形成,并且参与NMDA受体介导的神经元死亡,那么nNOS-PSD-95耦联是否能够影响焦虑相关情绪。目前nNOS-PSD-95小分子解耦联剂包括ZL006和IC87201。目前的研究显示ZL006在脑卒中中具有显著的神经保护作用,并且能够促进神经元的再生。在啮齿类动物研究中,单次给予ZL006或者IC87201二十四小时后会产生显著的抗抑郁样效果,但并不产生抗焦虑样作用。本文的研究对象是ZL006-05,ZL006-05是由ZL006与(+)-2-莰醇(Borneol)通过酯键连接,从而解决ZL006 口服不吸收的问题。而Borneol是一种萜类,也是中药饮片冰片的主要成分。Borneol在镇痛方面具有比较好的效应,对于焦虑方面的影响尚无人报道。前人的研究显示Borneol能够增强γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)诱导的电流,面临床上常用抗焦虑药地西泮也存在类似现象,提示我们Borneol也可能具有抗焦虑作用。那么,ZL006-05对于小鼠焦虑样行为有着怎样的影响呢?ZL006-05对于慢性不可预测应激(Chronic Unpredictable Stress,CUS)小鼠又有怎样的影响?ZL006和Borneol在这些过程中又分别扮演着什么样角色?为了回答这些问题,本课题设计了三部分内容:(1)验证ZL006-05是否具有抗焦虑样作用以及ZL006-05对于CUS小鼠行为的影响;(2)分别观察ZL006-05的两个组成部分ZL006和Borneol在抗焦虑方面的作用;(3)从ZL006-05的两个组成部分ZL006和Borneol入手,探索其抗焦虑的作用机制。第一部分为了研究ZL006-05是否存在抗焦虑样作用,我们通过灌胃的方式,分别给予ZL006-05 20,45和90mg/kg,单次给药一小时后进行焦虑相关行为学检测。实验结果显示灌胃给予ZL006-05一小时后具有抗焦虑样效应,可以显著增加在高架十字迷宫开臂的时间以及明暗箱中明箱的活动时间并存在一定的剂量依赖性,同时对于小鼠在旷场中的活动度没有任何影响。为了研究ZL006-05在焦虑病理模型上的作用,我们首先对CUS模型的可靠性进行验证,结果显示在造模结束之后一周,造模小鼠的焦虑水平还是维持在较高水平。分别在给药1小时(验证急性抗焦虑效应)、连续给药一周(验证持续给药对模型小鼠焦虑行为的影响)以及连续给药后停药一周(验证持续给药药效的维持)三个时间点对ZL006-05的药效进行行为学检测。从ZL006-05在三个时间点的行为学结果可以发现,ZL006-05对CUS小鼠具有急性抗焦虑作用,抗焦虑作用稳定并可维持。第二部分ZL006-05的药代动力学参数尚不清楚,但是ZL006-05应该是通过ZL006和Borneol两个靶点来发挥其效应的。我们有分别探究了 ZL006和Borneol在抗焦虑方面的特点。首先探究Borneol在正常小鼠上的抗焦虑样作用,发现Borneol存在显著的急性抗焦虑样作用,与前面的ZL006-05相类似。在CUS模型小鼠上,Borneol存在显著的急性抗焦虑作用,连续给药一周同样有效,但是停药一周后检测行为发现,Borneol的抗焦虑作用不能够维持。接着探索ZL006在小鼠抗焦虑方面的作用,同样首先检测其对于正常生理性小鼠上焦虑行为的影响。结果显示,ZL006对于小鼠的焦虑样行为是没有任何的影响的,这与之前文献报道结果一致。接着就在CUS模型小鼠下分别在给药Ⅰ小时、连续给药一周和连续给药停药一周三个时间点对ZL006的药效进行检测,发现ZL006的持续给药可以改善CUS所带来小鼠焦虑水平的提高,停药一周后仍然有效。第三部分我们分别从ZL006和Borneol两个组分入手来探索ZL006-05的作用机制。首先对Borneol的急性抗焦虑样作用的机制进行探索,电生理全细胞记录发现同时给予GABA和Borneol能够显著提高海马椎体细胞的GABA所引起的GABA电流的幅度。那么ZL006-05的急性抗焦虑作用是由Borneol带来的,可能是通过间接增强GABA这个抑制性递质的效果来实现的。然后对ZL006改善CUS后焦虑行为的机制进行初步探索。海马是焦虑情绪发生和调控的最重要脑区之一,同时慢性应激对其影响也是非常显著的。首先用我们用WestBlotting方法检测海马内synapsin和spinophilin的蛋白表达,发现在ZL006的持续给药能够逆转由CUS所带来的海马synapsin和spinophilin表达的降低。同时进行Golgi染色实验,检测ZL006解耦联对神经元突触可塑性的影响,结果显示阻断nNOS-PSD-95耦连,显著增加了树突棘的密度,提高神经元的突触可塑性。接着,为了进一步验证ZL006对于CUS后焦虑行为的调控,分别在海马DG区局部给予LV-nNOS-N1-133-GFP和ZL006后进行行为学检测,发现与全身持续给予ZL006类似,能够部分改善CUS所导致的焦虑水平的异常产生抗焦虑作用。那么ZL006-05在CUS小鼠上持续抗焦虑作用则是由ZL006这个靶点所带来的,其机制可能是通过改善慢性应激所导致小鼠海马突触可塑性损伤。