目的：急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一种恶性血液系统肿瘤,以不成熟的T淋巴细胞母细胞恶性增殖为特点。临床以联合化疗为主,但出现复发和化疗抵抗的几率较高。而复发和化疗抵抗的病例预后往往较差。近年来,Y-分泌酶抑制剂(y-secretase inhibitors, GSIs)对T-ALL的治疗作用备受关注。缘于GSIs是一类可以抑制NOTCH1激活的小分子化合物,而大量的研究显示NOTCH1通路的异常活化在T-ALL中扮演重要角色。但到目前为止GSIs的临床实验却没有取得突破。原因在于GSIs出现了临床治疗抵抗并且伴有剂量依赖性的胃肠道毒性反应。本研究以中药穿心莲的主要活性成分穿心莲内酯(Andrographolide)为研究对象。体外选择GSIs抵抗的T-ALL细胞系,探究穿心莲内酯克服GSIs抵抗和恢复GSIs敏感性的作用及机制。并观察穿心莲内酯对健康人外周血淋巴细胞的作用,明确穿心莲内酯的安全性和选择性。构建GSIs抵抗的T-ALL动物模型,证实穿心莲内酯体内克服GSIs抵抗和恢复GSIs敏感性的作用。同时观察穿心莲内酯与GSIs合用对GSIs胃肠道毒性的缓解作用。方法：穿心莲内酯体外克服GSIs抵抗及对健康人外周血淋巴细胞的影响。MTS法观察穿心莲内酯及其衍生物对CRFF-CEM和Jurkat细胞增殖活力的影响,并计算EC50值。穿心莲内酯单用及与DAPT(GSI-IX)合用干预CRFF-CEM和Jurkat细胞。DAPT是一种新型的GSIs,同样具有抑制NOTCH1活化的作用。MTS法检测细胞增殖活力,细胞计数记录细胞增殖曲线。Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡。PI染色检测细胞周期的变化。分离健康人外周血淋巴细胞,以2,4,8,16μm的穿心莲内酯干预,测定细胞增殖活力和细胞凋亡情况。穿心莲内酯对引起GSIs抵抗的关键蛋白及通路的调控作用。穿心莲内酯单用或与DAPT合用干预CRFF-CEM和Jurkat细胞。蛋白免疫印迹检测经NOTCH1胞内活化形式NICD以及PI3K/Akt/S6通路中的关键蛋白pAkt和pS6的表达。蛋白免疫印迹检测CRFF-CEM和Jurkat细胞中c-Myc和Mcl-1的蛋白表达,RT-PCR相对定量c-Myc和Mcl-1的mRNA表达。蛋白免疫印迹测定穿心莲内酯对CRFF-CEM和Jurkat细胞NF-κB通路中的p105/p50, p65,IKKβ和IKBa蛋白表达的调控。穿心莲内酯恢复GSIs敏感性的关键位点。检测c-Myc抑制剂10058-F4单用及与DAPT合用对CRFF-CEM和Jurkat细胞增殖活力和凋亡的影响。检测P13K抑制剂PI-103单用及与DAPT合用抑制CRFF-CEM和Jurkat细胞增殖和诱导凋亡的作用。检测10058-F4,PI-103,DAPT三者合用对NICD,c-myc,p-Akt和pS6表达的影响。观察10058-F4,PI-103,DAPT三者合用对CRFF-CEM和Jurkat细胞增殖活力及凋亡的影响。MCL1的shRNA克隆慢病毒侵染Jurkat细胞,沉默Mcl-1的转录激活和表达。检测DAPT对Mcl-1沉默的Jurkat细胞的增殖活力和凋亡作用的影响。穿心莲内酯体内克服GSIs抵抗及缓解GSIs的胃肠道毒性。BAlB/c裸鼠皮下注射Jurkat细胞悬液构建GSIs抵抗的T-ALL人癌异体移植瘤模型。穿心莲内酯200mg/kg, DAPT 25mg/kg,及两者合用灌胃干预荷瘤BAlB/c裸鼠20天,记录肿瘤体积变化并计算肿瘤抑制率。免疫组化检测肿瘤组织中Ki-67和Caspase-3表达变化。蛋白免疫印迹检测肿瘤组织中NICD, pAkt,p65,c-Myc,pS6及Mcl-1的蛋白表达。25mg/kg DAPT, 100mg/kg DAPT,200mg/kg穿心莲内酯,200mg/kg穿心莲内酯+25mg/kg DAPT灌胃干预C57BL/6小鼠7天。取C57BL/6小鼠十二指肠,HE染色观察肠道上皮杯状细胞病理变化。结果：穿心莲内酯对CRFF-CEM和Jurkat均表现出较强的抑制细胞增殖的作用,EC50分别为2.604μM和3.782μM。而内酯环脱去-OH的穿心莲内酯的衍生物则对细胞活力没有明显影响。DAPT对CRFF-CEM和Jurkat的细胞活力,凋亡及周期均没有明显影响。穿心莲内酯对DAPT抵抗的CRFF-CEM和Jurkat的细胞具有抑制细胞增殖活力,诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期的作用。而与DAPT合用后抑制增殖,诱导凋亡和阻滞周期的作用增强。穿心莲内酯不引起明显的健康人外周血淋巴细胞的凋亡,且具有一定的促进增殖的作用。穿心莲内酯对NICD也具有一定的抑制作用。而且可以下调超活化的PI3K/Akt通路中关键蛋白pAkt和pS6的表达。穿心莲内酯下调FBXW7突变所致的c-Myc和Mc1-1过表达,同时抑制MYC和MCL1的转录激活。穿心莲内酯还能够重新激活DAPT对c-Myc的抑制作用。穿心莲内酯抑制NF-κB通路的激活。相对p105/p50,主要下调p65的表达。还能够抑制上游激活型号IKKβ的表达,但是却没有提高掩盖NF-κB的核定位信号的IκBα的表达。c-Myc抑制剂10058-F4和P13K抑制剂P1-103均可以抑制CRFF-CEM和Jurkat细胞的增殖。但是并没有恢复DAPT抑制细胞增殖和诱导凋亡作用。10058-F4,PI-103和DAPT三者合用对PI3K/Akt/S6通路,c-Myc和NICD均具有较强的抑制作用。10058-F4和PI-103两者合用相较各自单用抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用更强。但是10058-F4,PI-103和DAPT三者合用恢复DAPT抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用仍然有限。DAPT对MCL1被沉默的Jurkat细胞表现出一定的抑制增殖和诱导凋亡作用。穿心莲内酯抑制了BAlB/c裸鼠的Jurkat细胞皮下移植瘤的生长。DAPT没有表现出抑制肿瘤生长的作用。但是穿心莲内酯和DAPT合用后抑制肿瘤生长的作用更明显。穿心莲内酯抑制肿瘤组织中反应细胞增殖活跃程度的Ki-67的表达而增强凋亡蛋白Caspase-3的表达。穿心莲内酯和DAPT联合干预对Ki-67的抑制作用和Caspase-3的上调作用更强。DAPT体内依然具有对NICD较强的抑制作用。穿心莲内酯和DAPT合用在体内也保持了对NICD,pAkt,p65,c-Myc,pS6和Mcl-1的表达的抑制作用,与体外细胞实验的结果一致。100mg/kg DAPT灌胃7天引起C57BL/6小鼠十二指肠上皮细胞出现明显杯状细胞化生。而降低剂量以25mg/kg的DAPT灌胃C57BL/6小鼠7天,小鼠十二指肠未出现明显的病理变化。同样,200mg/kg穿心莲内酯和25mg/kg DAPT联用也没有引起C57BL/6小鼠十二指肠的明显病理改变。结论：穿心莲内酯抑制GSIs抵抗的细胞增殖,诱导凋亡,阻滞分裂周期。并且能够一定程度恢复DAPT的敏感性。内酯环上的-OH对穿心莲内酯活性的保持非常重要。穿心莲内酯不引起健康人外周血淋巴细胞的凋亡,还具有一定的刺激增殖作用。穿心莲内酯本身也具有一定的抑制NOTCH1胞内活化的作用。而其对GSIs抵抗的细胞依然保持较强的抑制作用可能与以下机制有关。(1)下调PTEN缺失或失活引起的PI3K/Akt通路超活化。(2)抑制FBXW7突变导致的c-Myc过表达,并能够重新激活DAPT对c-Myc的抑制作用。(3)阻滞由FBXW7突变继发的Mcl-1过表达而引起的凋亡逃逸。(4)抑制NF-κB通路的激活。单纯抑制c-Myc和PI3K/Akt通路并不能恢复DAPT的敏感性。同时抑制c-Myc和PI3K/Akt通路对DAPT敏感性的恢复作用也有限。而抑制MCL1的转录激活和表达可能是恢复GSIs敏感性的关键。穿心莲内酯体内依然具有抗T-ALL的活性,并且能够恢复DAPT在体内的活性。穿心莲内酯抑制肿瘤细胞在体内的增殖并诱导凋亡,对与T-ALL发病密切相关的蛋白的作用与体外细胞实验结果一致。穿心莲内酯和低剂量的DAPT合用能够缓解DAPT剂量依赖性的胃肠道毒性。