平欧杂种榛(Corylus heterophylla Fisch.×Corylus avellana L.)为中国榛属植物(Corylus)的主要栽培品种,是重要的经济林树种,其多表现为自交不亲和。平欧杂种榛的栽培需要配置合理的优良授粉品种,同时其种质创新目前也主要通过杂交育种获得,因此,平欧杂种榛自交不亲和性的研究对其丰产栽培和种质创新均具有极重要的意义。经典遗传学认为榛属植物属于孢子体型自交不亲和,但对其S位点及其相关基因的分子研究还处于起步阶段。本研究以平欧杂种榛的主要栽培品种‘达维’为材料,对其不同亲和性授粉、授粉后不同时间的雌蕊进行了转录组测序分析,并基于其测序数据筛选和验证了适合榛属植物实时荧光定量PCR的稳定内参基因;在此基础上,利用RACE技术基于转录组测序数据对平欧杂种榛S位点相关基因进行了克隆,以期从分子层面对榛属自交不亲和性进行深入研究。主要获得以下结果:1.平欧杂种榛转录组测序本研究利用Illumina HiSeq 2000平台对平欧杂种榛不同亲和性组合、授粉后不同时期的雌蕊进行转录组测序,总计产出42,046,035,660 nt数据,注释Unigene 56,177个,比对和预测编码蛋白框53,054个,涉及COG分类26个、GO分类55个,注释代谢通路128个。IC4处理与其他处理的样品比对结果表明,在自交不亲和组合中,授粉后4 h是榛子自交不亲和研究的关键处理和时期。此外,基于转录组测序数据的Blast比对和SMART比对结果证实,榛属植物确实属于孢子体自交不亲和。2.平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与确定基于转录组测序数据和前人的相关研究共筛选获得12个候选内参基因。反转录PCR产物琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR溶解曲线均表明,针对候选内参基因所设计的引物特异性均良好。引物评价结果显示,引物扩增效率E值在86.3-121.6%之间,R2值均大于0.98,其线性回归方程可信。通过程序geNorm、Normfider、Bestkeeper和Delta Ct法基于荧光定量PCR所获得的Cq值,分别评估了候选内参基因在24个样品(不同组织器官、自交授粉后不同时间的雌蕊与不同亲和性授粉后4h的雌蕊)中的稳定性。最终筛选出本试验样品最合适的稳定内参基因ChaActin和ChaEF1-α,并利用已发表的欧洲榛Cav Prx基因对其进行了表达分析的验证,结果表明上述内参基因在榛属植物基因表达分析中具有实用性,可用于其自交不亲和相关基因的表达分析。3.平欧杂种榛S位点相关基因的克隆与分析基于筛选所得的Unigene,利用RACE克隆技术,克隆获得了8个S位点相关基因(ChaTHL1/ChaTHL2,ChaMLPK,ChaExo70A1,ChaARC1,ChaMOD1/ChaMOD2和ChaKAPP)的cDNA编码区全长序列。进行了编码框预测、蛋白质理化性质与结构分析、氨基酸序列结构域和功能预测及进化分析等生物信息学分析,结果表明:1)ChaTHL1和ChaTHL2所编码的蛋白均为稳定性蛋白、其存在一个thioredoxin结构域、具有蛋白质二硫氧化还原酶活性,在进化中属于THL类蛋白;2)ChaMLPK为碱性亲水性稳定蛋白、富含磷酸化位点(53个)、具有一个STKs结构域,与核桃(Juglans regia)的蛋白激酶APK 1A序列亲缘关系最近;3)ChaARC1为酸性亲水性稳定蛋白,具有泛素化转移酶活性、存在一个U-box和两个ARM结构域,与核桃含有U-box结构域的蛋白序列亲缘关系最近;4)ChaExo70A1为碱性亲水蛋白、存在一个Exo结构域、属于胞外分泌复合体,与核桃Exo70A1亲缘关系最近;5)Cha MOD1和ChaMOD2均为碱性疏水蛋白,属于PIP家族,是膜的组成部分、参与物质转运过程;6)ChaKAPP为酸性亲水蛋白、具有磷蛋白磷酸酶活性、存在一个FHA和一个PP2C结构域,与核桃PP2C 70序列亲缘关系最近。以本研究筛选所得的稳定基因(ChaActin和ChaEF1-a)作为双内参基因,利用荧光定量PCR对上述基因进行了表达分析,结果表明:1)ChaMLPK和ChaMOD1/ChaMOD2在花粉中几乎无表达,但在其他组织中均有表达,其余5个基因为组成型表达,在各组织器官中均有一定量的表达存在;2)在自交不亲和授粉后24小时内ChaTHL1/ChaTHL2、ChaARC1和ChaKAPP均在2 h时表达量达到最高,而ChaMLPK,ChaMOD1和ChaExo70A1在24 h时达到最高,ChaMOD2则在1 h时达到最高值。