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颞下颌关节骨关节病(Osteoarthritis,OA)是一类严重影响日常咀嚼、语言功能的骨关节病,其病程迁延,临床常发生开口弹响、疼痛和运动受限,其中过大负荷与其发生和发展密切相关,是主要的病因。MAPK通路的持续激活与OA的发展密切相关,通过调节MAPK通路的活性来治疗OA是国际上的研究热点之一。但是MAPK通路涉及分子众多,目前研究手段又往往依赖于外源性阻断剂,如U0126和PD98059。如何寻找关键的切入分子从内源性进行调控是急需解决的问题。研究验证Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是颞下颌关节病的重要候选基因,而RKIP是MAPK通路中唯一、关键的负向调控蛋白。因此,我们使用Flexce115000张力加载系统构建体外机械刺激模型探讨RKIP在颞下颌关节OA中的作用及分子机制。第一部分:RKIP介导大鼠颞下颌关节软骨细胞对动态张应力的应答反应目的:探讨机械刺激诱导软骨细胞基质合成和降解过程中RKIP的表达及作用。方法:(1)分离培养及鉴定大鼠髁突软骨细胞。采用两步酶消化法培养原代髁突软骨细胞,使用二型胶原染色和甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞。(2)取三代大鼠髁突软骨细胞,随机分为对照组和加力组。静态培养作为对照组,加力组加载周期性机械张应力(形变:16%,频率:1HZ)3,6,12,24h。加载后即刻,1day和3day分别检测细胞增殖能力,Real-time PCR检测基质合成(CollagenⅡ,Aggrecan,TIMP4)和降解(MMP13)相关指标的表达水平。Western blot检测RKIP表达水平,免疫荧光检测p-ERK时空表达水平。(3)通过慢病毒转染技术下调软骨细胞RKIP表达水平,观察加载状态下Collagen Ⅱ和Aggrecan的表达水平。结果:(1)与静态培养对照组对比,连续加载6h组对细胞增殖无显著影响(P>0.05);连续加载12h和24h组,加载后即刻增殖显著增加(P<0.05),加载后lday和3day增殖明显低于静态培养组(P<0.05)。(2)Collagen Ⅱ表达水平在加载6h后显著上升(P<0.05),24h后下降至静态对照水平以下;Aggrecan表达水平在加载3 h,6 h和12 h后明显升高(6 h达到高峰),24 h下降至静态对照水平;基质降解指标(MMP13)表达水平与加载时间成正比;抑制基质降解指标(TIMP4)表达水平与加载时间成反比,24 h下降至静态对照水平。(3)机械张力持续加载3h,6h,12h和24h后,RKIP表达水平持续上升(12h组达到高峰)。机械张力持续加载24h,p-ERK胞核表达增加。(4)RKIP低表达加力6h组Collagen Ⅱ和Aggrecan表达量低于单纯加力6h组,24h组则无显著差异。结论:机械张应力作用下关节基质蛋白组成逐渐失调,表现为维护软骨力学性质的(Aggrecan)减少,基质合成代谢(Collagen Ⅱ)和分解代谢(MMP13)均旺盛以及代偿性的软骨增殖活跃。这种代偿性的软骨细胞增殖与正常状态下的细胞增殖不同,最终转归不是关节软骨内环境的恢复,而是导致关节软骨力学性质的破坏,细胞生存的胞外基质环境发生变化,细胞分化状态改变。RKIP在此过程中起到协调蛋白质组成的作用。第二部分:RKIP在实验性开he引起的大鼠颞下颌关节软骨退变中的表达变化目的:研究RKIP在大鼠颞下颌关节软骨退行性变中的表达。方法:10只6周龄SD雌性大鼠,随机分成两组,实验组被动张口 3h/天,开口度25mm,持续5天。Microct分析髁突软骨下骨骨密度,甲苯胺蓝染色观察髁突软骨厚度及糖原表达,免疫组化观察软骨内CollagenⅡ和RKIP时空表达。结果:较对照组,实验组关节软骨下骨密度下降(P<0.05),骨表面界限模糊,关节后区有组织缺损区,关节软骨层厚度下降,软骨基质中collagenⅡ表达水平下降,且在关节后区和上区有显著差异(后区P=0.005,上区P=0.0002),RKIP主要分布于关节软骨肥大层细胞胞浆中,表达水平在关节各区均下降(后区P=0.000,上区 P=0.0015,前区 P=0.0047)。结论:持续性大张口可诱导大鼠颞下颌关节早期的关节炎样变:软骨层变薄,软骨基质减少,软骨下骨骨密度下降,骨质异常缺损。RKIP在此病变过程中表达显著减少,提示RKIP可能对颞下颌关节软骨破坏起到负向调节作用。