雌激素(estrogen)作为女性体内重要的调节类固醇激素,不仅对女性生殖系统的生长和发育至关重要,而且对维持心血管系统、骨骼系统和神经系统的正常功能发挥重要作用。女性在绝经期,内源性雌激素水平快速下降,更年期综合征,骨质疏松、心血管疾病和老年性痴呆等疾病的发病率随之上升。传统的雌激素替代疗法虽然可缓解上述更年期症状,但长期使用容易产生高血凝状态、高血压、水肿、痴呆等副作用,并增加乳腺癌及子宫内膜癌等妇科肿瘤的发病风险。因此,研究和开发高效且毒性作用较低的雌激素替代物已经成为治疗更年期综合征等疾病的重点。植物雌激素(phytoestrogens)是从天然植物中提取的结构与内源性雌激素相似的一类化合物。这些物质可以与体内雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合发挥双向调节的作用。在体内雌激素水平较低的情况下发挥类雌激素样的作用;在体内雌激素水平较高时的情况下发挥抗雌激素的作用。近年来,植物雌激素作为重要的选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators,SERMs)在更年期综合征等疾病的治疗发面发挥重要作用。许多天然产物具有来源广泛、类型多样、不良反应较小等优点,在植物雌激素的开发和应用方面极具潜力。本研究的主要目的是为了研究红茶提取物、石斛提取物的植物雌激素样作用,以及石斛红茶混合物提取物的协同作用。同时,对它们可能的作用机制加以研究,为植物雌激素的开发和应用提供新的思路和实验依据。为了研究红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物的雌激素样作用,我们首先运用经典的E-SCREEN筛选法,通过MTT实验检测它们对ER(+)细胞系T47D增殖的影响。实验结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物均能够促进ER(+)细胞的增殖,其中石斛红茶混合物提取物的效果最好。由于红茶提取物,石斛提取物的成分复杂,推测其中的一些成分可能发挥了一定的协同作用。进一步的研究发现红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物产生的的促增殖效应可以被雌激素受体拮抗剂ICI182 780拮抗。为了进一步验证上面的结果,我们在ER(-)细胞系MDA-MB-231和ER敲除的T47D细胞中进行实验。结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物对ER(-)细胞和ER敲除的T47D细胞没有明显的增殖效应。这说明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物是具有雌激素样作用的,并且依赖于雌激素受体。我们进一步研究了红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物雌激素样作用的相关机制。通常情况下,细胞增殖的与细胞周期的密切相关,因此我们检测了红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物对细胞周期的影响。流式细胞检测的结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物可以促进ER(+)细胞S期的比例增加,说明三种提取物均促进了细胞DNA合成,加快了细胞周期活动。同时,通过细胞吉姆萨染色实验也证实了上面的结果,红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物处理ER(+)细胞后,分裂期细胞数量明显高于对照组。这些结果说明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物通过增加细胞周期活动来发挥促细胞增殖的作用。雌激素信号传导机制分为非基因组效应和基因组效应,而这些效应均与细胞增殖和细胞周期调控密切相关。其中,非基因组效应主要是通过激活ER介导的PI3K/AKT信号传导通路和ERK信号传导通路来实现的。所以为了进一步阐述红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物促细胞增殖的潜在机理,我们首先检测其对ER介导的PI3K/AKT和ERK信号传导通路的影响。实验结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物均可以增加ERα的磷酸化水平来激活雌激素信号通路,并增加下游PI3K、AKT和ERK的磷酸化水平,这说明三种提取物均可以激活ER介导的PI3K/AKT和ERK信号通路。同时,我们发现红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物对雌激素信号通路的激活效应可以被雌激素受体拮抗剂ICI182 780阻断。这些结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物通过雌激素受体激活了雌激素信号通路,发挥了一定的雌激素样作用。基因组效应是通过调节ER下游的靶基因来发挥作用的。所以我们研究红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物对ER下游靶基因的影响。结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物可以上调ER及PGR的mRNA水平和蛋白水平。同时,它们也可以上调ER下游靶基因PS2和cyclin D1的mRNA水平。而且红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物促进下游靶基因转录的效应可以被雌激素受体拮抗剂ICI182 780抑制。这些结果表明红茶提取物、石斛提取物和石斛红茶混合物提取物具有雌激素样的作用,通过促进ER下游靶基因的转录发挥了雌激素的基因组效应。综上所述,红茶提取物和石斛提取物具有植物雌激素作用,而石斛红茶混合物提取物具有更强的植物雌激素作用,这可能依赖于其中某些成分的协同作用。研究潜在的机制可能是三种提取物均通过激活ER介导的PI3K/AKT和ERK信号通路(非基因组效应)和上调ER下游靶基因的表达(基因组效应),促进细胞周期活动来发挥的植物雌激素样作用。本研究为在植物雌激素的开发和应用提供了理论依据。